中鏈甘油三酯、三油酸甘油酯對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　甘油三酯，又稱為脂肪，是體內(nèi)能量的主要來(lái)源，由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，根據(jù)其碳鏈長(zhǎng)度的不同可被分為：1)短鏈甘油三酯(Short Chain Triglycerides, SCT)：碳鏈上的碳原子數(shù)小于6的甘油三酯；2)中碳鏈甘油三酯(Medium Chain Triglycerides, MCT)：碳鏈上的碳原子數(shù)介于6～12的甘油三酯；3)長(zhǎng)碳鏈甘油三酯(Long Chain Triglycerides,

2、 LCT)：碳鏈上的碳原子數(shù)大于12的甘油三酯。高甘油三酯血癥是指血漿甘油三酯≥150mg/dl(即≥1.7mmol/L)。流行病學(xué)的研究結(jié)果表明高甘油三脂血癥可增加心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)脈粥樣硬化是最常見(jiàn)的一種血管病變，血管平滑肌細(xì)胞增殖是其顯著性的臨床病理學(xué)特征。長(zhǎng)鏈甘油三酯是體內(nèi)脂肪的主要成分，有研究表明氧化的富甘油三酯的低密度脂蛋白(ox-LDL)與血管平滑肌細(xì)胞的增殖有關(guān)，中鏈甘油三酯能降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水

3、平，并能抑制動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中促炎因子的產(chǎn)生。但是，中鏈甘油三酯，三油酸甘油酯對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，迄今未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬以大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，以中鏈甘油三酯、三油酸甘油酯為處理因素，觀察二者對(duì)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，觀察其時(shí)效、量效的關(guān)系，為臨床合理控制高甘油三酯血癥提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：中鏈甘油三酯及三油酸甘油酯分別設(shè)置六個(gè)劑量組：62.5mg/dl組、125

4、mg/dl組、250mg/dl組、500mg/dl組、1000mg/dl組，2000mg/dl組，同時(shí)，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組；每組均觀察共六個(gè)時(shí)間點(diǎn)：24h、48h、72h、96h、120h、144h。
　　2.構(gòu)建大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)體系，進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　3.油紅染色法觀察脂質(zhì)浸潤(rùn)情況及細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　4.按照上述實(shí)驗(yàn)分組及時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置，分別用含不同濃度的中鏈甘油三酯及三油酸甘油酯的培養(yǎng)基，培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈

5、血管平滑肌細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。
　　5.同樣的實(shí)驗(yàn)分組和時(shí)間點(diǎn)設(shè)置，分別用含不同濃度的中鏈甘油三酯及三油酸甘油酯的培養(yǎng)基，培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。
　　6.同樣的實(shí)驗(yàn)分組和時(shí)間點(diǎn)設(shè)置，分別用含不同濃度的中鏈甘油三酯及三油酸甘油酯的培養(yǎng)基，培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的凋亡百分比。
　　

6、結(jié)果:
　　1.血管平滑肌細(xì)胞鑒定結(jié)果：
　　在倒置顯微鏡下，細(xì)胞外觀多為平滑長(zhǎng)梭形。核呈圓形、卵圓形。細(xì)胞可出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象，“峰-谷樣”生長(zhǎng)；免疫熒光鑒定結(jié)果顯示抗肌動(dòng)蛋白抗體染色陽(yáng)性，表明所獲細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞。
　　2.油紅染色結(jié)果：
　　中鏈甘油三酯：脂質(zhì)浸潤(rùn)始于125mg/dl，隨著濃度的增高，浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)量有所增加；高濃度情況下(2000mg/dl),細(xì)胞形態(tài)變化較明顯，胞體變大變圓，細(xì)胞突起增多

7、，呈不規(guī)則形。
　　三油酸甘油酯：與對(duì)照組相比，脂質(zhì)浸潤(rùn)程度明顯，與三油酸甘油酯濃度正相關(guān)，這種明顯的變化始于125mg/dl；細(xì)胞形態(tài)變化較明顯，胞體變大，失去原有的長(zhǎng)梭形外觀，在2000mg/dl濃度刺激下，已經(jīng)沒(méi)有正常細(xì)胞的存在。
　　3.MTT結(jié)果：
　　中鏈甘油三酯：24h、48h，隨著中鏈甘油三酯濃度的升高，大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖率出現(xiàn)不規(guī)則性升高，≥250mg/dl時(shí)則表現(xiàn)為抑制增殖作用，在1000m

8、g/dl時(shí)增殖率最低。72h-144h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在低濃度(<250mg/dl)時(shí)，增殖率與對(duì)照組相差不大，≥250mg/dl時(shí)表現(xiàn)為抑制增殖作用，在1000mg/dl時(shí)增殖率最低。
　　三油酸甘油酯：24h，在低濃度(≤125mg/dl)時(shí)增殖率隨著濃度升高而下降，而≥250mg/dl時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)增殖作用，在1000mg/dl時(shí)增殖率達(dá)最大約為115.9％(t=﹣3.7377,p=0.0022)。48h、72h，<500mg/

9、dl時(shí)，隨著三油酸甘油酯濃度的升高增殖率不斷增長(zhǎng)，在500mg/dl時(shí)達(dá)最大，增殖率基本與對(duì)照組相同；>500mg/dl時(shí)，表現(xiàn)為明顯的抑制增殖作用，2000mg/dl的增殖率最低。96h-144h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，完全表現(xiàn)為抑制增殖作用，在62.5-125mg/dl時(shí)，增殖率顯示為下降趨勢(shì)；125-500mg/dl基本為平臺(tái)期，增殖率幾乎無(wú)變化；>500mg/dl時(shí)，增殖率下降，其中500-1000mg/dl下降最明顯。
　　4.流

10、式周期結(jié)果：
　　中鏈甘油三酯：24h，與對(duì)照組相比，隨著中鏈甘油三酯濃度的升高， G0/G1期百分比先微弱的下降而后慢慢升高，250mg/dl為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，與對(duì)照組相比下降約16.7%(t=3.2553，p=0.0058)；S期百分比微弱增加，500mg/dl達(dá)最大；G2/M期的百分比也逐漸增大，250mg/dl達(dá)最大值，之后基本保持這一數(shù)值。48h，各期比例趨勢(shì)與24h相似，低濃度(≤250mg/dl)時(shí)，G0/G1期百分比與濃度

11、呈負(fù)相關(guān)，最小值發(fā)生在250mg/dl；S期百分比先增加后下降，轉(zhuǎn)折點(diǎn)在250mg/dl；G2/M期百分比隨著濃度增加變化不大。72h、96h、120h，各期百分比隨著濃度的增加，基本無(wú)變化。144h， G0/G1期百分比與濃度呈負(fù)相關(guān)，2000mg/dl的百分比最低；S期百分比與濃度呈正相關(guān)，2000mg/dl的百分比約為19.5%(t=-10.0462，p<0001)；G2/M期在低濃度(≤250mg/dl)時(shí)，百分比逐漸下降，>2

12、50mg/dl時(shí)，該期的百分比幾乎為0。
　　三油酸甘油酯：24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的趨勢(shì)基本一致，G0/G1期在62.5mg/dl時(shí)的百分比較對(duì)照組降低，62.5mg/dl-1000mg/dl濃度區(qū)間所對(duì)應(yīng)的百分比幾乎無(wú)變化，2000mg/dl時(shí)，百分比又上升，基本上回到對(duì)照組的水平；S期百分比相應(yīng)的在62.5mg/dl時(shí)較對(duì)照組增加，之后基本不變，在2000mg/dl時(shí)又明顯下降；G2/M期百分比大致為先增加后降低的趨

13、勢(shì)，這種趨勢(shì)在24h很微弱，48h相對(duì)較明顯，在250mg/dl時(shí)達(dá)最大值，與對(duì)照組相比增加約6.4%(t=-7.9942，p<0.0001)。96h、120h、144h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的趨勢(shì)基本一致，G0/G1期百分比隨著濃度的增加呈微弱的逐漸下降的趨勢(shì)，1000mg/dl時(shí)為最低；相應(yīng)的S期百分比隨著濃度的升高而增加，1000mg/dl時(shí)的百分比分別為15.5%(t=-5.2561,p=0.0001)、13.8%(t=-11.8158，

14、p<0.0001)及24.9%(t=-20.8513，p<0.0001)；G2/M期在96h，隨著三油酸甘油酯濃度的升高表現(xiàn)為微弱的下降趨勢(shì)，>500mg/dl，G2/M期百分比先增高后降低與同濃度S期的趨勢(shì)一致。120h時(shí)，隨著濃度的升高，G2/M期百分比微弱升高，在2000mg/dl達(dá)最大值8.6%(t=-18.5389，p<0.0001)。144h時(shí)， G2/M期百分比幾乎為0，并且不隨濃度的變化而變化。
　　5.流式凋亡結(jié)

15、果：
　　中鏈甘油三酯：24h，≤500mg/dl時(shí)為促進(jìn)凋亡作用，這種作用與中鏈甘油三酯濃度呈負(fù)相關(guān)。48h，隨著中鏈甘油三酯濃度的增加，凋亡百分比總體呈遞增的趨勢(shì)，除了62.5mg/dl，500mg/dl兩個(gè)點(diǎn)的凋亡百分比略小于對(duì)照組。72h、96h、120h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡百分比趨勢(shì)大致相同，表現(xiàn)為抑制凋亡作用，而且這種作用與濃度的變化關(guān)系不大。144h，各濃度組的凋亡百分比較72h、96h、120h都有明顯的增加，各濃度組

16、與對(duì)照組相比，表現(xiàn)為抑制凋亡作用；2000mg/dl組除外，其值為6.4%(t=-2.5669,p=0.0224)，表現(xiàn)為輕度促進(jìn)凋亡作用。
　　三油酸甘油酯：24h，各濃度組的凋亡百分比均高于對(duì)照組，表現(xiàn)為促凋亡作用。<500mg/dl時(shí)，促凋亡作用隨著濃度增高而降低，>500mg/dl時(shí)，凋亡百分比又增加。48h，≤1000mg/dl組的凋亡百分比與對(duì)照組接近，趨勢(shì)變化不明顯，2000mg/dl時(shí)，與對(duì)照組相比凋亡百分比明顯的

17、增加，達(dá)13%(t=-9.4442，p<0.0001)。72h、96h、120h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡變化趨勢(shì)一致，≤1000mg/dl都表現(xiàn)為抑制凋亡作用并且這一濃度區(qū)間的凋亡百分比幾乎無(wú)變化，2000mg/dl凋亡百分比都明顯的上升。144h，各濃度組的凋亡百分比較其他時(shí)間點(diǎn)的要高，總體呈現(xiàn)促凋亡作用，在125mg/dl-1000mg/dl濃度區(qū)間，凋亡百分比與三油酸甘油酯的濃度呈明顯的正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　中鏈甘油三酯及

18、三油酸甘油酯作為體內(nèi)甘油三酯的組成成分及能量來(lái)源，對(duì)血管平滑肌的直接作用是復(fù)雜的。本研究結(jié)果顯示，二者對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響與時(shí)間和濃度都有關(guān)系。
　　中鏈甘油三酯大致在低濃度(≤250mg/dl)，短時(shí)間(24h，48h)表現(xiàn)為促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，周期分析在對(duì)應(yīng)的濃度及時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為 G0/G1期的降低及 S期的升高，凋亡結(jié)果為促進(jìn)凋亡；≥500mg/dl，72-144h表現(xiàn)為抑制增殖作用，周期分析表現(xiàn)為S期百

19、分比降低，凋亡結(jié)果為抑制凋亡。
　　三油酸甘油酯在24h，≤125mg/dl，表現(xiàn)為抑制增殖；24h，≥250mg/dl及48-72h，≤500mg/dl，表現(xiàn)為促進(jìn)增殖作用；48-72h，>500mg/dl及≥96h的各濃度點(diǎn)，表現(xiàn)為抑制增殖作用；流式周期結(jié)果表明，S期在24h-72h較對(duì)照組升高，這種增高與三油酸甘油酯濃度變化的關(guān)系不大。在96h-144h時(shí)，S期百分比增加更明顯，而且這種升高與濃度呈正相關(guān)。凋亡結(jié)果顯示，24

20、h，表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡的作用，并且這種作用與濃度呈負(fù)相關(guān)；48h無(wú)明顯的促進(jìn)或抑制凋亡作用；72-120h為抑制凋亡作用；長(zhǎng)時(shí)間(144h)及高濃度(2000mg/dl)有明顯的促進(jìn)凋亡作用。
　　可見(jiàn)，無(wú)論是中鏈甘油三酯還是三油酸甘油酯，其對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響都不是單一性的。根據(jù)它們的濃度及作用時(shí)間的不同可以分別表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制增殖作用。
　　細(xì)胞增殖的變化與細(xì)胞周期密切相關(guān)，促增殖作用時(shí)，表現(xiàn)為G0/G1期的降低