mir--210在乳腺癌細胞控制通路下游基因表達及其關(guān)聯(lián)性的實驗研究.pdf

1、目的：全球范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均居于女性惡性腫瘤首位，年新發(fā)病例約170萬（占年女性癌癥新發(fā)病例的25％），是女性中最常見的癌癥，近年來，乳腺癌發(fā)病率及死亡率均呈明顯上升趨勢，并出現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重危害女性生命安全。mir-210位于人類基因組編碼位點(chr11：568089-568198)，與缺氧途徑緊密相關(guān)，是一種經(jīng)典的缺氧反應性microRNA，癌細胞維持在缺氧狀態(tài)下仍能快速增殖，mir-210在缺氧細胞中常明顯上調(diào)，在

2、乳腺癌細胞分化中起重要作用，并參與乳腺癌腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預后的產(chǎn)生等，因此，通過探索mir-210在乳腺癌細胞中上調(diào)表達及相關(guān)機制，有望在乳腺癌的治療、療效評估及預后預測等取得一定的成果。本實驗通過對mir-210在乳腺癌中表達水平變化對下游基因蛋白表達的影響及其關(guān)聯(lián)性研究，探討mir-210表達對乳腺癌細胞控制通路的下游基因可能產(chǎn)生的影響，以期進一步探討mir-210對乳腺癌細胞增殖、遷徙與侵襲等可能存在的干預機制，為后續(xù)

3、基礎(chǔ)及臨床研究提供思路和參考。
　　方法：(1)篩選在乳腺癌中異常表達并具有統(tǒng)計學意義的microRNA。利用Perl（http：//www.perl.org/）軟件和R(https：//www.r-project.org/)軟件對TCGA(https：//cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌數(shù)據(jù)進行篩選，檢出在TCGA數(shù)據(jù)庫乳腺癌樣本中差異表達并具有統(tǒng)計學意義的microRNA。通過在線下載乳腺癌高通量測

4、序-microRNA表達譜數(shù)據(jù)，獲得乳腺癌樣本的microRNA表達譜數(shù)據(jù)。(2)通過pubmed數(shù)據(jù)庫篩選由其他研究證實與目標microRNA相拮抗的下游基因，通過The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)查找高表達該基因的細胞系用作Western blot實驗的陽性參照。(3)實驗選用來自細胞庫液氮保存的人乳腺癌MDA-MB-231細胞株，經(jīng)細胞復蘇、貼壁培養(yǎng)、傳代，

5、制備均勻細胞懸液，計數(shù)、稀釋完畢，進行分組。(4)通過陽離子脂質(zhì)體法(Lipofection)將候選microRNA瞬時轉(zhuǎn)染至目標乳腺癌細胞株，并用Real-time qPCR檢測轉(zhuǎn)染效果。Trizol試劑提取RNA細胞株，TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對收集的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄使所用的microRNA上下游引物為莖環(huán)法(Stem-Loop Method)設(shè)計的基因特異性引物，選用U6作為內(nèi)參，再用qPCR反應體系進行擴增，擴增用引物，

6、PCR儀熒光定量測定。(5)采用RIPA裂解液試劑提取總蛋白，酶聯(lián)免疫檢測儀(MicroplateReader)分析計算待測樣品蛋白濃度。(6)取出待測樣本，采用Western-blot技術(shù)，上樣、轉(zhuǎn)膜、anti-MNT及anti-GAPDH等，暗室內(nèi)采用增強化學發(fā)光法(Enhanced Chemiluminecence，ECL)對反應底物進行膠片顯影、定影及凝膠成像掃描。檢測驗轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞株內(nèi)候選microRNA轉(zhuǎn)錄水平及其下游基

7、因蛋白的表達水平，通過對比，檢驗乳腺癌細胞株中候選microRNA水平及其對下游基因表達水平是否改變。(7)通過基于cDNA測序的基因表達譜對比，分析轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞株內(nèi)差異表達的基因。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)過R軟件分析，從TCGA的1103例乳腺癌組織microRNA表達譜樣本中篩選出差異表達有統(tǒng)計學意義的microRNA共393個，其中高表達301個，低表達92個。(2)mir-210位列高表達組第13位，F(xiàn)DR(False D

8、iscovery Rate)為2.81E-51，logFC(log2Fold Change)約為3.2176，有統(tǒng)計學意義。通過mirBase Tracker（http：//www.mirbasetracker.org/）網(wǎng)站追溯mirBase（http：//www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫信息，將mir-210基因名更新為mir-210-3p，并從中選出mir-210下游基因MNT，通過The Human Protein Atl

9、as網(wǎng)站篩選出MNT高表達的Hela細胞株作為陽性參照組。(3)MDA-MB-231乳腺癌細胞及Hela細胞生長狀況良好，細胞株復蘇后快速進入細胞生長對數(shù)期，傳代或凍存周期約為間隔1日。提取各組樣本總RNA，濃度均大于1.5μg/μl，A260/280值均1.8～2.0。經(jīng)Real-time qPCR檢測，與對照組相比，mir-210-3p Inhibitors轉(zhuǎn)染組及mir-210-3p Inhibitors Negative Con

10、trol轉(zhuǎn)染組的細胞中mir-210-3p的表達水平均降低，Inhibitors組mir-210-3p的表達水平降至對照組的0.037倍。(4)提取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h的對照組、mir-210-3p Inhibitors Negative Control轉(zhuǎn)染組和mir-210-3p Inhibitors轉(zhuǎn)染組的MDA-MB-231乳腺癌細胞總蛋白，經(jīng)過考馬斯亮藍染色法(Coomassie Blue Staining，CBS)染色后，酶聯(lián)免疫

11、檢測儀(MicroplateReader)測得樣品濃度分別為：5.286/5.479/3.645μg/μl。陽性參照組Hela細胞總蛋白樣品測得濃度為7.184μg/μl。各個樣品定量取40μg總蛋白，用Western-blot檢測MNT蛋白表達水平，對照組MNT蛋白低表達，mir-210-3p Inhibitors Negative Control轉(zhuǎn)染組以及mir-210-3pInhibitors轉(zhuǎn)染組中MNT蛋白表達水平均出現(xiàn)提高，

12、Inhibitors組較另外兩組更為明顯，與Real-time qPCR結(jié)果相符。(5)送測序RNA樣品編號1(對照組）、編號2（Inhibitors轉(zhuǎn)染組）定量與純度A260/A280分別為1.9和1.92，A260/A230分別為2.34和2.15。RIN值分別為10.50和9.90，質(zhì)量檢測結(jié)果通過，樣本完整性良好可用于芯片實驗。(6)通過cDNA芯片表達譜對比，共篩選出差異表達基因316個，其中上調(diào)基因數(shù)176個，下調(diào)基因數(shù)14

13、0個。(7)KEGG的信號通路富集分析：在轉(zhuǎn)染mir-210-3p Inhibitors后的MDA-MB-231乳腺癌細胞株中，差異表達基因主要在致癌錯誤轉(zhuǎn)錄（Transcriptional misregulation in cancer）、MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信號傳導通路和趨化因子信號通路(Chemokine Signaling Pathway)信號通路中出現(xiàn)富集(En

14、richment)。(8)Gene Ontology(GO)富集分析：差異表達基因影響趨化因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活物活性及RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolymeraseⅡ)核心啟動子近端區(qū)域序列的特異性結(jié)合，差異基因產(chǎn)物多位于核染色質(zhì)，質(zhì)膜，質(zhì)膜組件，膜的錨定組分(Anchored Component Of Membrane)，CHOP-ATF3復合物及蛋白復合物。
　　結(jié)論：(1)通過生物信息學分析獲