mir--210在乳腺癌細(xì)胞控制通路下游基因表達(dá)及其關(guān)聯(lián)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：全球范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均居于女性惡性腫瘤首位，年新發(fā)病例約170萬(wàn)（占年女性癌癥新發(fā)病例的25％），是女性中最常見的癌癥，近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病率及死亡率均呈明顯上升趨勢(shì)，并出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害女性生命安全。mir-210位于人類基因組編碼位點(diǎn)(chr11：568089-568198)，與缺氧途徑緊密相關(guān)，是一種經(jīng)典的缺氧反應(yīng)性microRNA，癌細(xì)胞維持在缺氧狀態(tài)下仍能快速增殖，mir-210在缺氧細(xì)胞中常明顯上調(diào)，在

2、乳腺癌細(xì)胞分化中起重要作用，并參與乳腺癌腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的產(chǎn)生等，因此，通過探索mir-210在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)及相關(guān)機(jī)制，有望在乳腺癌的治療、療效評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)等取得一定的成果。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)mir-210在乳腺癌中表達(dá)水平變化對(duì)下游基因蛋白表達(dá)的影響及其關(guān)聯(lián)性研究，探討mir-210表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞控制通路的下游基因可能產(chǎn)生的影響，以期進(jìn)一步探討mir-210對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷徙與侵襲等可能存在的干預(yù)機(jī)制，為后續(xù)

3、基礎(chǔ)及臨床研究提供思路和參考。
　　方法：(1)篩選在乳腺癌中異常表達(dá)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的microRNA。利用Perl（http：//www.perl.org/）軟件和R(https：//www.r-project.org/)軟件對(duì)TCGA(https：//cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，檢出在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)乳腺癌樣本中差異表達(dá)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的microRNA。通過在線下載乳腺癌高通量測(cè)

4、序-microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，獲得乳腺癌樣本的microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)。(2)通過pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)篩選由其他研究證實(shí)與目標(biāo)microRNA相拮抗的下游基因，通過The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)查找高表達(dá)該基因的細(xì)胞系用作Western blot實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性參照。(3)實(shí)驗(yàn)選用來(lái)自細(xì)胞庫(kù)液氮保存的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇、貼壁培養(yǎng)、傳代，

5、制備均勻細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、稀釋完畢，進(jìn)行分組。(4)通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體法(Lipofection)將候選microRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至目標(biāo)乳腺癌細(xì)胞株，并用Real-time qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。Trizol試劑提取RNA細(xì)胞株，TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)收集的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄使所用的microRNA上下游引物為莖環(huán)法(Stem-Loop Method)設(shè)計(jì)的基因特異性引物，選用U6作為內(nèi)參，再用qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增用引物，

6、PCR儀熒光定量測(cè)定。(5)采用RIPA裂解液試劑提取總蛋白，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(MicroplateReader)分析計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。(6)取出待測(cè)樣本，采用Western-blot技術(shù)，上樣、轉(zhuǎn)膜、anti-MNT及anti-GAPDH等，暗室內(nèi)采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(Enhanced Chemiluminecence，ECL)對(duì)反應(yīng)底物進(jìn)行膠片顯影、定影及凝膠成像掃描。檢測(cè)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)候選microRNA轉(zhuǎn)錄水平及其下游基

7、因蛋白的表達(dá)水平，通過對(duì)比，檢驗(yàn)乳腺癌細(xì)胞株中候選microRNA水平及其對(duì)下游基因表達(dá)水平是否改變。(7)通過基于cDNA測(cè)序的基因表達(dá)譜對(duì)比，分析轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)差異表達(dá)的基因。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)過R軟件分析，從TCGA的1103例乳腺癌組織microRNA表達(dá)譜樣本中篩選出差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的microRNA共393個(gè)，其中高表達(dá)301個(gè)，低表達(dá)92個(gè)。(2)mir-210位列高表達(dá)組第13位，F(xiàn)DR(False D

8、iscovery Rate)為2.81E-51，logFC(log2Fold Change)約為3.2176，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過mirBase Tracker（http：//www.mirbasetracker.org/）網(wǎng)站追溯mirBase（http：//www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫(kù)信息，將mir-210基因名更新為mir-210-3p，并從中選出mir-210下游基因MNT，通過The Human Protein Atl

9、as網(wǎng)站篩選出MNT高表達(dá)的Hela細(xì)胞株作為陽(yáng)性參照組。(3)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞及Hela細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞株復(fù)蘇后快速進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，傳代或凍存周期約為間隔1日。提取各組樣本總RNA，濃度均大于1.5μg/μl，A260/280值均1.8～2.0。經(jīng)Real-time qPCR檢測(cè)，與對(duì)照組相比，mir-210-3p Inhibitors轉(zhuǎn)染組及mir-210-3p Inhibitors Negative Con

10、trol轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中mir-210-3p的表達(dá)水平均降低，Inhibitors組mir-210-3p的表達(dá)水平降至對(duì)照組的0.037倍。(4)提取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h的對(duì)照組、mir-210-3p Inhibitors Negative Control轉(zhuǎn)染組和mir-210-3p Inhibitors轉(zhuǎn)染組的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色法(Coomassie Blue Staining，CBS)染色后，酶聯(lián)免疫

11、檢測(cè)儀(MicroplateReader)測(cè)得樣品濃度分別為：5.286/5.479/3.645μg/μl。陽(yáng)性參照組Hela細(xì)胞總蛋白樣品測(cè)得濃度為7.184μg/μl。各個(gè)樣品定量取40μg總蛋白，用Western-blot檢測(cè)MNT蛋白表達(dá)水平，對(duì)照組MNT蛋白低表達(dá)，mir-210-3p Inhibitors Negative Control轉(zhuǎn)染組以及mir-210-3pInhibitors轉(zhuǎn)染組中MNT蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)提高，

12、Inhibitors組較另外兩組更為明顯，與Real-time qPCR結(jié)果相符。(5)送測(cè)序RNA樣品編號(hào)1(對(duì)照組）、編號(hào)2（Inhibitors轉(zhuǎn)染組）定量與純度A260/A280分別為1.9和1.92，A260/A230分別為2.34和2.15。RIN值分別為10.50和9.90，質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果通過，樣本完整性良好可用于芯片實(shí)驗(yàn)。(6)通過cDNA芯片表達(dá)譜對(duì)比，共篩選出差異表達(dá)基因316個(gè)，其中上調(diào)基因數(shù)176個(gè)，下調(diào)基因數(shù)14

13、0個(gè)。(7)KEGG的信號(hào)通路富集分析：在轉(zhuǎn)染mir-210-3p Inhibitors后的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株中，差異表達(dá)基因主要在致癌錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄（Transcriptional misregulation in cancer）、MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路和趨化因子信號(hào)通路(Chemokine Signaling Pathway)信號(hào)通路中出現(xiàn)富集(En

14、richment)。(8)Gene Ontology(GO)富集分析：差異表達(dá)基因影響趨化因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活物活性及RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolymeraseⅡ)核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列的特異性結(jié)合，差異基因產(chǎn)物多位于核染色質(zhì)，質(zhì)膜，質(zhì)膜組件，膜的錨定組分(Anchored Component Of Membrane)，CHOP-ATF3復(fù)合物及蛋白復(fù)合物。
　　結(jié)論：(1)通過生物信息學(xué)分析獲