腎移植長(zhǎng)期存活患者免疫系統(tǒng)衰老的研究.pdf

1、研究目的
　　 對(duì)于終末期腎病患者而言，腎移植是理想的的替代療法之一。尤其是近十年來，靶向T細(xì)胞的新興免疫抑制劑的推廣應(yīng)用，顯著降低了排斥反應(yīng)的程度和發(fā)生頻率，并由此延長(zhǎng)了患者的壽命和提高了患者的生活質(zhì)量，使得該替代療法的應(yīng)用更為廣泛和有效。但是，長(zhǎng)期過度的免疫抑制會(huì)增加感染、腫瘤及各種并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)會(huì)，反過來又會(huì)影響患者的生活質(zhì)量和存活。因此，很有必要建立一套免疫監(jiān)視系統(tǒng)，用來防止不必要的或過度的免疫抑制。
　　 隨著

2、機(jī)體的生理性衰老，免疫系統(tǒng)也隨之逐漸發(fā)生退化，即免疫衰老。這個(gè)過程廣泛影響到包括固有免疫和適應(yīng)性免疫在內(nèi)的所有成分，造成有效免疫應(yīng)答能力下降或應(yīng)答失敗，導(dǎo)致機(jī)體易患各種感染性疾病、癌癥和自身免疫性疾病。在某些特殊的情形下，如機(jī)體持續(xù)暴露和對(duì)抗各種抗原和有害刺激時(shí)，免疫系統(tǒng)更易發(fā)生早衰，這種早衰是不依賴于生理性衰老的。衰老對(duì)免疫系統(tǒng)最顯著的影響是T細(xì)胞發(fā)育和功能的受損，主要表現(xiàn)為初始T細(xì)胞的生成減少，記憶和效應(yīng)T細(xì)胞的堆積和克隆擴(kuò)增，對(duì)抗

3、原刺激的增殖能力降低，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力下降，產(chǎn)生有效的淋巴因子的能力受損等。從分子機(jī)制上來看，衰老的T細(xì)胞表現(xiàn)為縮短的端粒、降低的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)表達(dá)水平及端粒酶活性。
　　 如上所述，T細(xì)胞是免疫抑制劑作用的主要靶點(diǎn)和免疫應(yīng)答的核心成分。長(zhǎng)期服用免疫抑制劑是否會(huì)造成T細(xì)胞的衰老?目前，對(duì)這一問題還不清楚。本研究以服用免疫抑制劑的腎移植長(zhǎng)期存活患者為研究對(duì)象，以端粒和端粒酶為研究的切入點(diǎn)，通過對(duì)他們外周血中T細(xì)胞

4、的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析，來探討和闡明這一問題。
　　 研究方法
　　 1.腎移植患者和健康對(duì)照的選取。以54例服用免疫抑制劑的腎移植長(zhǎng)期存活患者作為研究對(duì)象，中位年齡為48歲(25～68歲)，腎移植時(shí)間≥4年，中位移植時(shí)間為5.5年(4～12.5年)。以年齡/性別匹配的54例健康個(gè)體作為對(duì)照?；颊吆徒】祵?duì)照的T細(xì)胞分別從他們的外周血中分離獲得。
　　 2.RNA抽取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。應(yīng)用UIXRASPECTM-Ⅱ

5、RNA試劑盒提取T細(xì)胞的總RNA。cDNA合成過程中選用了逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和隨機(jī)引物六聚體(N6)。以β2-微球蛋白(β2-M)的表達(dá)作為RNA抽取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的內(nèi)參對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)在ABI7700 sequence detector機(jī)器上操作，應(yīng)用SYBR Green熒光染料，以閾值循環(huán)數(shù)Ct值來計(jì)算hTERT和P16INK4amRNA的表達(dá)水平，以B2-M作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)。不同處

6、理的T細(xì)胞分別被不同熒光標(biāo)記的抗體染色。本研究中應(yīng)用的抗體有CD3、CD4、CD8、CD25和CD28，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置同型對(duì)照。經(jīng)過孵育和漂洗后，應(yīng)用貝克曼流式細(xì)胞儀對(duì)上述T細(xì)胞表面分子的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，采用Cell Quest軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。體外培養(yǎng)的T細(xì)胞來源于腎移植患者和年齡/性別匹配的健康對(duì)照的外周血或者健康個(gè)體的buffy coats。使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和鏈霉素、2m

7、M L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基，在溫度為37℃、含5％CO2的孵箱罩進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。為了研究靜息T細(xì)胞的活化增殖能力，在培養(yǎng)的T細(xì)胞中加入了致有絲分裂原成分刀豆蛋白(ConA，10μg/ml)。為了進(jìn)一步探討免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞的影響，在上述活化的T細(xì)胞中加入了臨床常用的免疫抑制劑環(huán)孢素A(CysA)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，ConA和不同濃度的CysA(2.5μM、10μM)可單獨(dú)或共同孵育T細(xì)胞。
　　 5.DNA抽取和端

8、粒長(zhǎng)度測(cè)定。T細(xì)胞基因組DNA采用苯酚/氯仿的方法提取。采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法測(cè)量端粒的長(zhǎng)度。β-globin(HBG)的表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照。端粒長(zhǎng)度以T/S的比值來估計(jì)。
　　 6.端粒酶活性的測(cè)定。端粒酶活性的測(cè)定基于TRAP為基礎(chǔ)的PCRELISA方法，采用羅氏公司的端粒酶PCR ELISA試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。首先采用CHAPS裂解蛋白的方法提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，后續(xù)PCR ELISA的實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)樣本的上樣量為1μg蛋

9、白。端粒引物的延伸步驟結(jié)束之后，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。通過過氧化物酶催化底物TMB發(fā)生的顏色變化來檢測(cè)端粒酶的活性。以酶標(biāo)儀上樣本的吸光值OD450nm-690nm作為估計(jì)的指標(biāo)。
　　 7.統(tǒng)計(jì)分析方法。腎移植患者和健康對(duì)照T細(xì)胞的hTERT表達(dá)水平、端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度、p16INK4α表達(dá)水平和T細(xì)胞表面分子表達(dá)之間的差異采用Student t-test。所有的檢驗(yàn)均采用雙尾檢驗(yàn)法。P值小于0.05作為統(tǒng)計(jì)顯著性的臨

10、界值。
　　 研究結(jié)果
　　 1.腎移植長(zhǎng)期存活患者CD8+CD28-T細(xì)胞亞群百分比明顯升高。本研究的54例患者中，除2例患者的外周血血常規(guī)結(jié)果未收集外，52例患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：在白細(xì)胞計(jì)數(shù)中，除2例患者的計(jì)數(shù)略微升高，3例患者的計(jì)數(shù)略微降低外，其余47位患者的計(jì)數(shù)均在正常范圍內(nèi)；在淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)中，除2例患者的計(jì)數(shù)下降外，其余50例患者的計(jì)數(shù)均在正常的范圍內(nèi)。但是對(duì)T細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8和

11、CD28)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果表明，與年齡/性別匹配的健康對(duì)照相比，腎移植患者T細(xì)胞CD8+CD28-亞群的比例顯著增高。結(jié)果表明腎移植長(zhǎng)期存活患者存在免疫早衰的跡象。
　　 2.腎移植長(zhǎng)期存活患者T細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度明顯縮短。端粒的長(zhǎng)短經(jīng)常被用來評(píng)估細(xì)胞有絲分裂的歷史及衰老的現(xiàn)狀。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)量了腎移植長(zhǎng)期存活患者和年齡/性別匹配的健康對(duì)照外周血T細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度。結(jié)果顯示：與年齡/性別匹配的健康對(duì)照(1

12、.139±0.100)相比，腎移植長(zhǎng)期存活患者的端粒長(zhǎng)度(0.983±0.100)明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)。
　　 3.腎移植長(zhǎng)期存活患者T細(xì)胞的端粒酶活性和hTERT的表達(dá)水平顯著下降。為了探討腎移植長(zhǎng)期存活患者T細(xì)胞縮短的端粒長(zhǎng)度是否與端粒酶的活性改變有關(guān)，我們采用以TRAP為基礎(chǔ)的PCR ELISA方法，對(duì)腎移植長(zhǎng)期存活患者和年齡/性別匹配的健康對(duì)照外周血中T細(xì)胞的端粒酶活性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示：腎移

13、植患者T細(xì)胞的基礎(chǔ)端粒酶活性水平(0.161±0.010)顯著低于健康對(duì)照(0.242±0.020)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。另外，活化的T細(xì)胞可以誘導(dǎo)端粒酶的活性，而T細(xì)胞的活化受到有絲分裂原或其他刺激物的調(diào)節(jié)。基于此，本研究進(jìn)一步探討了刀豆蛋白(ConA)對(duì)端粒酶活性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明：經(jīng)ConA處理的腎移植患者的端粒酶活性(0.474±0.10)仍明顯低于健康對(duì)照的端?；钚?0.743±0.130)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、意義(P=0.045)。
　　 端粒酶是由多個(gè)亞單元組成的復(fù)合物，其關(guān)鍵成分人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)作為催化亞基，控制和調(diào)節(jié)著端粒酶的活性。在T細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)水平通常和端粒酶的活性程度保持一致。為了驗(yàn)證這一問題，我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)腎移植長(zhǎng)期存活患者和年齡/性別匹配的健康對(duì)照的外周血中T細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示：腎移植患者T細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)水平(0.18

15、7±0.04)與健康對(duì)照hTERT mRNA的表達(dá)水平(0.335±0.007)相比，下降顯著(P=0.025)。這似乎表明了腎移植患者T細(xì)胞下調(diào)的hTERT mRNA水平導(dǎo)致了端粒酶活性的下降。
　　 4.腎移植長(zhǎng)期存活患者T細(xì)胞p16INK4αmRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)。p16INK4α是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制因子，也是腫瘤抑制因子，在端?？s短和其他因素誘導(dǎo)的細(xì)胞衰

16、老中扮演著關(guān)鍵的角色。本研究探討了腎移植長(zhǎng)期存活患者和年齡/性別匹配的健康對(duì)照外周血中T細(xì)胞p16INK4αmRNA的表達(dá)水平是否存在差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，腎移植患者T細(xì)胞p16INK4αmRNA的表達(dá)水平(2.068±0.360)顯著高于健康對(duì)照組(0.950±0.034)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。
　　 5.體外實(shí)驗(yàn)證明，免疫抑制劑環(huán)孢素A能下調(diào)經(jīng)ConA活化的正常T細(xì)胞的端粒酶活性和hTERT的

17、表達(dá)水平。在對(duì)腎移植患者外周血T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了以下問題：免疫抑制劑對(duì)正常T細(xì)胞活化程度、端粒酶活性和hTERT表達(dá)水平的影響。從健康個(gè)體buffy coats中分離的T細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，分別單獨(dú)加入刀豆蛋白(ConA)孵育或者與不同濃度的環(huán)孢素A(CysA)共孵育。
　　 首先，本研究探討了CysA對(duì)ConA活化T細(xì)胞程度的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法，以T細(xì)

18、胞表面分子CD25作為衡量T細(xì)胞活化程度的指標(biāo)。結(jié)果表明：未經(jīng)任何處理的T細(xì)胞在體外培養(yǎng)48小時(shí)后，僅有不到10％的細(xì)胞表達(dá)CD25分子；而加入ConA孵育48小時(shí)后的T細(xì)胞，則有近90％的細(xì)胞表達(dá)CD25分子；若同時(shí)加入CysA和ConA孵育48小時(shí)后，只有70.29％的T細(xì)胞表達(dá)CD25分子，與只加ConA組相比，下降明顯。表明了免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞活化程度的下調(diào)作用。
　　 其次，本研究進(jìn)一步探討了經(jīng)CysA介導(dǎo)的活化程度降

19、低的T細(xì)胞端粒酶活性和hTERT表達(dá)水平的變化情況。結(jié)果表明，只加ConA活化后的T細(xì)胞端粒酶活性(0.317±0.071)和hTERTmRNA(6.690±1.948)表達(dá)水平顯著升高，若同時(shí)加入不同濃度CysA后的T細(xì)胞，其端粒酶活性(10μM CysA：0.082±0.008；2.5μM CysA：0.094±0.016)和hTERTmRNA的表達(dá)水平(10μM CysA：0.308±0.121；2.5μM CysA：1.174±

20、0.163)均顯著下降。
　　 總之，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果共同驗(yàn)證了免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)作用。因此，很有必要建立一套免疫監(jiān)視系統(tǒng)用來預(yù)防免疫系統(tǒng)過早的衰老。目前的研究結(jié)果雖然不能與臨床應(yīng)用建立即刻的聯(lián)系，但是該研究結(jié)果提示我們?cè)诮窈蟮呐R床實(shí)踐中，可以通過分析上述指標(biāo)來預(yù)測(cè)免疫系統(tǒng)衰老的程度，并根據(jù)此結(jié)果調(diào)整腎移植患者免疫抑制劑的用量，以提高該群體的生存質(zhì)量。
　　 結(jié)論
　　 腎移植長(zhǎng)期存活患者T細(xì)胞存在早衰