經(jīng)重組抗原P29誘導(dǎo)的免疫保護(hù)下細(xì)粒棘球蚴感染宿主后長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)的篩選.pdf

1、目的：
　　為了研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA是否參與了宿主免疫細(xì)胞分化的過(guò)程，本課題利用重組疫苗P29對(duì)動(dòng)物具有較好免疫保護(hù)力的作用，制備了疫苗免疫-病原體感染動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上研究在重組疫苗P29免疫誘導(dǎo)下及病原體感染后，長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)的情況，為解決寄生蟲(chóng)病研究中存在的宿主與病原體間免疫相互作用及免疫逃逸等難題探索新的途徑。
　　方法：
　　1.純化和制備細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組疫苗P29。
　　2.疫苗免疫-病原

2、體感染動(dòng)物模型的制備：將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、P29免疫+感染組和未免疫感染組。用重組疫苗免疫P29免疫+感染組小鼠（免疫3次），與第三次免疫間隔三個(gè)月后用細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴感染小鼠（空白對(duì)照組不感染）。分別在第一次免疫前、第三次免疫后2周、感染病原體后2周，小鼠眼球取血制備外周血淋巴細(xì)胞。感染6個(gè)月后處死P29免疫+感染組和未免疫感染組小鼠，統(tǒng)計(jì)包囊數(shù)，計(jì)算出重組疫苗P29所引起的免疫保護(hù)力。
　　3.提取總RNA

3、：利用TRIZOL法提取各組小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血淋巴細(xì)胞中總RNA。
　　4.構(gòu)建lncRNA和mRNA序列文庫(kù)：用Epicentre公司的Magnetic Core試劑盒進(jìn)行l(wèi)ncRNA的分離及建庫(kù)，用KAPA公司的KAPA Strand mRNA-SeqKit進(jìn)行mRNA的分離及建庫(kù)。用2％瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化后，用Agilent2100檢驗(yàn)文庫(kù)質(zhì)量。
　　5.高通量測(cè)序：構(gòu)建好的lncRNA和mRNA序列文庫(kù)用

4、Illumina公司HiSeq2000高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。
　　6.生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序碎片進(jìn)行拼接：用tophat2軟件進(jìn)行拼接，將高質(zhì)量reads比對(duì)到小鼠基因組上，并構(gòu)建各組、各時(shí)間點(diǎn)的lncRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄本。
　　7.生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)分子：用Cufflinks軟件對(duì)全部reads正態(tài)分布化，獲得可以相互比較的表達(dá)數(shù)據(jù)，用Cuffdiff軟件按照P value≤0.05且fold change≥2

5、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組免疫后2周、感染病原體后2周的lncRNA及mRNA表達(dá)量進(jìn)行差異分析。
　　8.注釋?zhuān)菏褂胠ncRNAdb數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lncRNAdb.org/）、UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)注釋差異表達(dá)的lncRNA。
　　9.lncRNA與對(duì)應(yīng)mRNA的關(guān)聯(lián)性分析：通過(guò)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)lncRNA及mRNA表達(dá)量的皮爾森系數(shù)（r），以r的絕對(duì)

6、值大于0.99為閾值，確定lncRNA與mRNA的相關(guān)關(guān)系。
　　10.對(duì)P29免疫+感染組及空白對(duì)照組免疫后差異表達(dá)lncRNA及相關(guān)mRNA分子進(jìn)行初步驗(yàn)證：將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組，免疫組，免疫組小鼠經(jīng)重組疫苗P29免疫3次，空白組不做處理，分別在第一次免疫前、第三次免疫后兩周眼球取血制備外周血淋巴細(xì)胞。TRIZOL法提取總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的lncRNA及相關(guān)mRNA分子進(jìn)行

7、初步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建疫苗免疫-病原體感染動(dòng)物模型，重組疫苗 P29免疫小鼠獲得了94.8%的免疫保護(hù)力。
　　2.成功提取總RNA，經(jīng)核酸蛋白微量分析儀測(cè)定各組總RNA OD260/OD280均在1.8-2.0之間，總量均超過(guò)5μg，滿足建庫(kù)要求。
　　3.成功構(gòu)建mRNA文庫(kù)及l(fā)ncRNA文庫(kù)，通過(guò)Agilent2100檢驗(yàn)，符合測(cè)序要求。
　　4.mRNA文庫(kù)測(cè)序結(jié)果：P29免疫+感

8、染組免疫后mRNA文庫(kù)獲得19717433條reads，其中高質(zhì)量reads共12375673條，比對(duì)率為94.2％。P29免疫+感染組感染后mRNA文庫(kù)獲得24908555條reads，其中高質(zhì)量reads共14766919條，比對(duì)率為94.8％。空白對(duì)照組免疫后mRNA文庫(kù)獲得25555287條reads，其中高質(zhì)量reads共15703026條，比對(duì)率為96.1％。空白對(duì)照組感染后mRNA文庫(kù)獲得23772436條reads，其中

9、高質(zhì)量reads共15251560條，比對(duì)率為96.3％。未免疫感染組感染后mRNA文庫(kù)獲得21539925條reads，其中高質(zhì)量reads共13748866條，比對(duì)率為95.1％。各文庫(kù)測(cè)序量均在4Gb以上。
　　5.lncRNA文庫(kù)測(cè)序結(jié)果：P29免疫+感染組免疫后lncRNA文庫(kù)獲得23367854條reads，其中高質(zhì)量reads共16756424條，比對(duì)率為85.1％。P29免疫+感染組感染后lncRNA文庫(kù)獲得218

10、03045條reads，其中高質(zhì)量reads共16449971條，比對(duì)率為87.6％。空白對(duì)照組免疫后lncRNA文庫(kù)獲得25501392條reads，其中高質(zhì)量reads共18047705條，比對(duì)率為84.7％?？瞻讓?duì)照組感染后lncRNA文庫(kù)獲得21803045條reads，其中高質(zhì)量 reads共16449971條，比對(duì)率為87.6％。未免疫感染組感染后lncRNA文庫(kù)獲得18171176條reads，其中高質(zhì)量reads共125

11、21894條，比對(duì)率為95.1％。各文庫(kù)測(cè)序量均在4Gb以上。
　　6.篩選差異表達(dá)分子結(jié)果：P29免疫+感染組和空白對(duì)照組免疫后差異表達(dá)的lncRNA共17個(gè)，mRNA共473個(gè)?？瞻讓?duì)照組與未免疫感染組感染后差異表達(dá)的lncRNA共14個(gè)，mRNA共85個(gè)。P29免疫+感染組和未免疫感染組感染后差異表達(dá)的lncRNA共30個(gè)，mRNA共192個(gè)。
　　7.lncRNA與對(duì)應(yīng)mRNA的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果：每個(gè)差異表達(dá)的lncR

12、NA與多個(gè)編碼蛋白基因顯著相關(guān)。
　　8.初步驗(yàn)證結(jié)果：對(duì)P29免疫+感染組及空白對(duì)照組免疫后差異表達(dá)lncRNA及相關(guān)mRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其中l(wèi)ncRNA靶分子X(jué)LOC-012763與對(duì)應(yīng)mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204與對(duì)應(yīng)mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE-028466與對(duì)應(yīng)mRNA Kler1、Jchain存在差異表達(dá)，與lncRNA與對(duì)應(yīng)mRNA關(guān)聯(lián)性分析結(jié)

13、果一致。
　　結(jié)論
　　1.獲得疫苗誘導(dǎo)下差異表達(dá)lncRNA共17個(gè)，mRNA共473個(gè)。獲得病原體感染下差異表達(dá)的 lncRNA共14個(gè)，mRNA共85個(gè)。獲得疫苗誘導(dǎo)病原體感染差異表達(dá)lncRNA共30個(gè)，mRNA共192個(gè)。
　　2.初步認(rèn)定lncRNA XLOC-012763與對(duì)應(yīng)mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204與對(duì)應(yīng)mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE