硒抑制樹(shù)突狀細(xì)胞成熟降低Th17細(xì)胞比例治療自身免疫甲狀腺炎的研究.pdf

1、Th22細(xì)胞是近年來(lái)新鑒定出的CD4+T細(xì)胞亞群，與Th17、Th1或Th2細(xì)胞不同的是，這種細(xì)胞在分泌IL-22的同時(shí)而不分泌IL-17、IFN-γ或IL-4，同時(shí)有著獨(dú)自的細(xì)胞分化途徑。許多研究表明Th22細(xì)胞在多種自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的作用。目前，關(guān)于自身免疫甲狀腺病(AITD)的Th22細(xì)胞研究十分有限，本研究將研究Th22細(xì)胞在AITD中的作用。
　　方法:
　　本研究共入選了59例AITD患者，所有患

2、者均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌門診。這包括23例橋本氏甲狀腺炎患者(HT)和36例Graves病(GD)患者，其中GD患者包括24例未治療的GD(uGD)患者，12例經(jīng)過(guò)治療甲功正常的GD(eGD)患者，另外還有21例健康自愿者(Control)。
　　采取空腹靜脈血，3ml抗凝靜脈血和3ml促凝靜脈血，所有入選的人均檢測(cè)了血清FT4、FT3、TSH、TPOAb及TGAb。無(wú)菌操作，使用梯度離心法從抗凝血中分離出外周血單個(gè)

3、核細(xì)胞(PBMC)。然后，我們使用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)了PBMCs中的Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞及Th1細(xì)胞的比例，同時(shí)分析了HT患者中Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的關(guān)系。另外，我們也分離出3ml促凝靜脈血中的血清，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)了所有人血清中IL-22、IL-17、IL-4及IFN-γ的含量。
　　我們?cè)诿拷M中各選取了部分患者，取血5ml為抗凝靜脈血，利用其中的PBMCs進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。在

4、Th22細(xì)胞體外極化條件下，將PBMCs體外培養(yǎng)6天，然后使用FACS檢測(cè)CD3+CD8-IL-22+細(xì)胞的比例，并使用ELISA方法檢測(cè)了上清液中IL-22的含量。
　　結(jié)果:
　　HT患者外周血Th22細(xì)胞比例（2.01±1.09％）比uGD組(0.78±0.48％，P＜0.001)，eGD組（0.67±0.46％，P＜0.001），和control組（0.71％±0.42％，P＜0.001）都有顯著增高。并且HT組患者

5、血清IL-22水平與Th22細(xì)胞比例顯著相關(guān)，且較其它組血清IL-22水平均升高。
　　HT組者外周血Th17細(xì)胞比例（3.17±1.31％）比uGD組(1.98±1.01％，P＜0.001),eGD組（1.53±0.62％,P＜0.001），和control組（1.69±0.63％,P＜0.001)也均顯著增高。但各組中血清IL-17水平無(wú)顯著差異。
　　在HT患者組中，分泌IL-22的Th17細(xì)胞占Th17細(xì)胞很大的比例

6、，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在HT患者中，外周血Th17細(xì)胞比例與Th22細(xì)胞比例成顯著正相關(guān)(R2=0.5711，P＜0.001)，同時(shí)血清IL-22水平與Th17細(xì)胞成顯著正相關(guān)(R2=0.3188, P=0.005)。
　　HT組患者和uGD組患者外周血Th1水平均較對(duì)照組輕度升高。同時(shí)uGD患者外周血Th2細(xì)胞比例較eGD組或control組人群均有顯著升高。
　　體外培養(yǎng)PBMCs，在Th22細(xì)胞極化條件下，可以培養(yǎng)出更高比例的

7、Th22細(xì)胞，同時(shí)來(lái)源于HT患者的PBMCs極化出的Th22細(xì)胞比例要高于其它組，上清液中IL-22水平也顯著增高。
　　結(jié)論:
　　本研究提示Th22細(xì)胞及Th17細(xì)胞在HT疾病中扮演了重要的作用。同時(shí)GD的發(fā)病可能與Th2細(xì)胞有關(guān)，而與Th22細(xì)胞或Th17細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)。
　　近年來(lái)的臨床研究發(fā)現(xiàn)硒干預(yù)可以治療自身免疫甲狀腺炎(AIT)，降低其外周血甲狀腺自身抗體水平，但是硒治療的免疫機(jī)制沒(méi)有被闡明。目前認(rèn)為在炎

8、癥反應(yīng)的抗原遞呈過(guò)程中，活性氧的升高扮演著重要的作用，而抗氧化劑可能通過(guò)抑制抗原遞呈細(xì)胞(APC)的激活而抑制炎癥反應(yīng)。本研究將建立硒治療AIT的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，首次從硒通過(guò)降低活性氧(ROS)水平降低抗原遞呈過(guò)程的角度去探討其治療自身免疫甲狀腺炎的免疫機(jī)制，并且將確定硒通過(guò)降低ROS作用于抗原遞呈過(guò)程的具體分子機(jī)制。
　　方法:
　　首先我們通過(guò)硒干預(yù)高碘誘發(fā)的自身免疫甲狀腺炎AIT小鼠模型進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。5-6周齡NOD

9、.H-2h4小鼠被隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、AIT組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)）、Se1組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)同時(shí)1 mg/kg含硒飼料喂養(yǎng)）、Se2.5組（含0.05％NaI飲水喂養(yǎng)同時(shí)2.5 mg/kg含硒飼料喂養(yǎng)）。干預(yù)12周后觀察干預(yù)效果及機(jī)制。1、測(cè)定甲狀腺濕重，并使用HE染色檢測(cè)甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。2、使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清TGAb水平。3、分離脾臟中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，檢測(cè)其中CD11c+

10、樹(shù)突狀細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86及MHCⅡ表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)其中Th17及Th1細(xì)胞比例。
　　而后我們以健康自愿者及橋本氏甲狀腺炎(HT)患者為研究對(duì)象，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。由單核細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得樹(shù)突狀細(xì)胞(Mo-DC)，在Mo-DC成熟的過(guò)程中，給予不同濃度(3，6，10，20)μM亞硒酸鈉或抗氧化劑(2mM) N-乙酰基-L-半胱氨酸NAC干預(yù)，觀察Mo-DC表面CD40、CD80、CD86及HLA-DR表達(dá)，并通過(guò)檢測(cè)

11、Mo-DC胞內(nèi)ROS水平和NF-κB激活，研究其成熟過(guò)程中ROS的作用及亞硒酸鈉體外干預(yù)效果及分子機(jī)制。其中細(xì)胞內(nèi)ROS水平使用活性熒光染料CM-H2DCFDA測(cè)定，并檢測(cè)NF-κB的激活。最后進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。在異體MLR中，檢測(cè)不同濃度亞硒酸鈉或NAC干預(yù)后的Mo-DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力。在自體MLR中，檢測(cè)不同濃度亞硒酸鈉或NAC干預(yù)后的樹(shù)突狀細(xì)胞刺激CD4+T細(xì)胞分泌IL-6和IL-17的水平。
　

12、　結(jié)果:
　　在體內(nèi)試驗(yàn)中，我們觀察到了高劑量硒干預(yù)組可以顯著減輕甲狀腺局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且降低血清TGAb水平。AIT組小鼠外周脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86及MHCⅡ水平較Control組顯著增高，AIT組小鼠外周脾臟Th17細(xì)胞比例較Control組顯著增高，而Se2.5組CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞表面CD80及CD86水平較AIT組有降低，而Se2.5組Th17細(xì)胞比例較AIT組有降低。
　

13、　在體外實(shí)驗(yàn)中，觀察到Mo-DC的成熟過(guò)程中胞內(nèi)ROS水平上調(diào)，P-p65水平增高。而(3，6，10，20)μM亞硒酸鈉或2mM NAC干預(yù)可以抑制其成熟過(guò)程中ROS水平提高，并且抑制其下游NF-κB的激活，并且抑制了Mo-DC表面CD40、CD80、CD86及HLA-DR的表達(dá)，并且抑制程度與硒干預(yù)濃度成正比。在異體MLR中，10μM亞硒酸鈉或2mM NAC干預(yù)后的Mo-DC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力減弱。在自體MLR中，10μM亞