新型結(jié)核病疫苗菌株的免疫保護效力和安全性研究.pdf

1、目的：本實驗擬對本課題組利用原生質(zhì)體融合技術以卡介苗（BCG）和結(jié)核分枝桿菌國際標準無毒株（H37Ra）為親本菌株所構建的新型結(jié)核病疫苗融合菌株（B/R菌株）的免疫保護效力和安全性進行初步研究。
　　方法：對B/R菌株的免疫保護效力和安全性的研究分別從動物實驗和細胞實驗兩部分進行。（1）動物實驗：將204只C57BL/6小鼠隨機分為四組：生理鹽水組（36只）、BCG組（56只）、B/R組（56只）、H37Ra組（56只），分別皮內(nèi)

2、接種無菌生理鹽水0.1 ml，BCG菌懸液0.1 ml、B/R菌株菌懸液0.1 ml、H37Ra菌株菌懸液0.1 ml（含活菌數(shù)為1×106個）。a：觀察接種后各組小鼠一般生存狀況及生存率，記錄接種后第3、6、9、12、15、18周小鼠體重數(shù)值。b:分別于接種后第2、3、6、9、12周時隨機抓取BCG組、B/R組、H37Ra組小鼠各4只脫頸處死后，摘取小鼠完整肺臟、脾臟；制成臟器組織勻漿并接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37℃細菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培

3、養(yǎng)20天后計菌落數(shù)(CFU)。c:分別于免疫后第3、6、9、12、15、18周，隨機抓取生理鹽水組、BCG組、B/R組、H37Ra組小鼠各6只脫頸處死后稱重；其中第3、6、9周小鼠處死前摘眼球取外周血分離血漿，用ELISA法測小鼠血漿中白細胞介素2（IL-2）及γ干擾素（IFN-γ）的水平；將處死后的小鼠打開胸腔、腹腔取肺臟、肝臟及脾臟于組織固定液中固定48小時（脾臟取出后稱重并記錄）制作病理切片行HE染色，觀察各組小鼠肺臟、肝臟、脾臟

4、在各時間點的病理變化情況。d:根據(jù)所記錄的各組小鼠體重和脾臟重量計算各組小鼠各時間點的脾臟系數(shù)。（2）細胞實驗：a:復蘇并培養(yǎng)巨噬細胞株RAW264.7，選擇狀態(tài)良好的細胞，分別用BCG、B/R、H37Ra菌株菌懸液感染細胞，利用Annexin V-FITC／PI雙染法分別檢測感染后第6小時、12小時、24小時各組細胞的凋亡率。b:提取收集正常C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞體外培養(yǎng)，分別用 CG、B/R、H37Ra菌株的菌懸液感染所

5、培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞，并在感染后第0、48、96小時用1％TritonX-100裂解液裂解巨噬細胞，將裂解得到的液體稀釋1000倍后取適量接種于羅氏培養(yǎng)基上，37℃細菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20天后計菌落數(shù)。
　　結(jié)果:(1）四組小鼠接種后第3、6、9、12、15、18周均無小鼠死亡，一般生存狀態(tài)良好，四組小鼠生存率均為100%；所有觀察時間點B/R組小鼠體重與生理鹽水組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（2）小鼠臟器菌落計數(shù)實

6、驗發(fā)現(xiàn)B/R菌株、BCG及H37Ra菌株均可在小鼠脾臟、肺臟內(nèi)定植生長，B/R菌株在小鼠脾臟、肺臟內(nèi)的定植力較BCG強，較H37Ra稍弱；差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（3）小鼠接種后第3周、6周、9周時血漿中IL-2及IFN-γ的水平，B/R組較BCG組高，較H37Ra組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（4）小鼠接種后，BCG組、H37Ra組及B/R組小鼠肺臟均表現(xiàn)出不同程度的炎細胞浸潤和氣道上皮細胞局部脫失，肺泡間隔增寬等

7、改變；肝臟均有不同程度的肝竇擴張淤血，匯管區(qū)炎細胞浸潤，小葉間肝細胞水樣變、壞死等改變，其中 BCG組與H37Ra組程度相當，B/R組病理改變程度較兩者稍輕。小鼠接種后，BCG組、H37Ra組及B/R組小鼠脾臟均有不同程度白髓比例升高，淋巴小結(jié)體積增大；紅髓區(qū)擴張淤血，可見多形核細胞及巨噬細胞增多等改變，其中H37Ra組及B/R組程度相當，二者均較BCG組改變明顯。（5）小鼠接種后第3、6、9、12周時小鼠脾臟系數(shù)，B/R組與生理鹽水組

8、相比顯著升高；差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；所有觀察時間點B/R組分別與H37Ra組、BCG組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。(6)細胞凋亡實驗提示BCG、B/R與H37Ra組均可誘導巨噬細胞株RAW264.7凋亡增加，B/R菌株誘導巨噬細胞凋亡能力與 BCG無異；較 H37Ra菌株增強，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（7）巨噬細胞內(nèi)增殖實驗發(fā)現(xiàn)BCG、B/R菌株、H37Ra菌株均可在小鼠腹腔巨噬細胞中生存繁殖，B/

9、R菌株在小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)的增殖能力與BCG相比無明顯差異；與H37Ra組相比降低，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.B/R菌株接種C57BL/6小鼠后不影響小鼠一般生長發(fā)育及生存時間。2.B/R菌株在C57BL/6小鼠體內(nèi)至少定植3個月，其定植力較BCG增強，較H37Ra菌株弱。3.B/R菌株在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘導細胞免疫應答水平較BCG顯著增強，較H37Ra菌株弱。4.細胞實驗結(jié)果表明B/R菌株的毒力與