口服狂犬病疫苗的制備和應(yīng)用研究.pdf

1、狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病,該病在全球分布很廣,每年死于狂犬病的人數(shù)超過5.5萬(wàn)人,其中約95％發(fā)生在亞洲和非洲。大多數(shù)死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致,受害者中30％～60％為15歲以下兒童?？袢〉念A(yù)防和治療通常采用狂犬病疫苗,對(duì)于嚴(yán)重感染者還須使用人源或馬源免疫球蛋白進(jìn)行治療。目前通過美國(guó)FDA認(rèn)證的狂犬病疫苗為神經(jīng)組織疫苗和Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗,其中Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗應(yīng)用最為廣泛,但因其制備成本高,注射方

2、式和保存方法要求嚴(yán)格等因素,一些落后、貧窮的國(guó)家仍采用有嚴(yán)重副反應(yīng)的神經(jīng)組織疫苗,而Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗也只是用于發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家。
　　 新一代狂犬病疫苗主要從以下幾方面進(jìn)行研究:(1)以腺病毒載體為基礎(chǔ)的重組病毒疫苗。這類疫苗雖能刺激新生小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的初次免疫應(yīng)答,但對(duì)成年動(dòng)物免疫效果還不明確,并且病毒載體還有整合至宿主染色體的潛在危險(xiǎn)。(2)DNA疫苗。這類疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體、CD4+細(xì)胞免疫和CD8+細(xì)

3、胞免疫反應(yīng),但注射要求高,免疫效率低,有一定的應(yīng)用局限。(3)減毒疫苗。這類疫苗可快速并大量復(fù)制狂犬病病毒糖蛋白,免疫效果好且為單劑量注射,但抗體產(chǎn)生具有遲滯性特點(diǎn),不能及時(shí)進(jìn)行暴露后治療,而且病毒中致病性成份還需通過分子手段進(jìn)一步去除,以降低潛在的致病危險(xiǎn)。(4)抗體疫苗。這類疫苗采用雞尾酒療法效果良好,有望替代人源或馬源免疫球蛋白。但因狂犬病毒株有地域差異特點(diǎn),導(dǎo)致病毒株糖蛋白基因型多樣化,通過單一毒株制備的單克隆抗體不具有良好的適

4、應(yīng)性。
　　 消化道給藥治療是通過口服含有治療性的外源物質(zhì),利用消化道吸收功能,使外源物質(zhì)達(dá)到特定部位,糾正出錯(cuò)基因或表達(dá)分泌出治療性蛋白,發(fā)揮治療性作用,從而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目的。重組微生物體是目前研究較多的口服藥物運(yùn)送載體之一,它通過消化道給藥可以以低劑量的方式達(dá)到與普通胃腸道藥物載體給藥相似的治療效果。重組微生物在消化道內(nèi)釋放生物活性物質(zhì)主要通過三種方式,一通過細(xì)胞自溶釋放胞內(nèi)物質(zhì)；二活性物質(zhì)錨定于細(xì)胞壁:三活性物質(zhì)自

5、細(xì)胞分泌到消化腔內(nèi)。為進(jìn)行這一研究,本課題選擇的微生物載體為釀酒酵母。重組酵母進(jìn)入消化道后如果存活,就可能會(huì)繼續(xù)進(jìn)行分泌或通過自溶為機(jī)體提供G蛋白。外源蛋白在消化道環(huán)境中易形成乳糜微粒,這些微粒可通過淋巴管進(jìn)入消化道具有豐富的粘膜毛細(xì)血管中,進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),被輸送至包括血液在內(nèi)的各個(gè)臟器,引起免疫反應(yīng),最終刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。
　　 為探索這一研究的可行性,我們首先通過生物信息學(xué)手段對(duì)實(shí)驗(yàn)用狂犬病病毒糖蛋白基因CVS2

6、4-G進(jìn)行分析,確定了該蛋白的常規(guī)理化性質(zhì)和基本結(jié)構(gòu):(1)CVS24糖蛋白分子大小約58.4kD,等電點(diǎn)為7.27。(2)該蛋白全長(zhǎng)524aa,其中1～19aa為信號(hào)肽(Ss),28～458aa為膜外區(qū)域,459～478aa為跨膜區(qū)(TD),479～524aa為膜內(nèi)區(qū)。(3)該蛋白去除信號(hào)肽后產(chǎn)生505aa的成熟蛋白,成熟蛋白上有四個(gè)糖基化位點(diǎn),分別位于37aa,247aa,319 aa和480 aa。(4)通過CVS24-G與常用疫

7、苗株3aG/PV/CTN的基因比對(duì),發(fā)現(xiàn)CVS24-G基因與3aG/PV的G基因同源性達(dá)90％以上,與CTN株同源性達(dá)87％以上,糖基化位點(diǎn)與三種疫苗株基本一致。(5)結(jié)合蛋白質(zhì)的柔性區(qū)間,抗原指數(shù),表面可及指數(shù)和親水性分析,預(yù)測(cè)CVS24-G蛋白可能的抗原表位區(qū)間為67～74,264～269,275～283,295～307,321～324,326～339,376～380,407～415。與目前已知的抗原位點(diǎn)相比,該蛋白的關(guān)鍵抗原表位位

8、點(diǎn)330 aa,333 aa和339 aa位點(diǎn)在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)。CVS24-G與其它三種疫苗株相比,除Ser(34)位為Arg(34)替代外,其余表位均表現(xiàn)一致。其中在決定毒株致病力的K330和R333位點(diǎn)上,CVS24-G與其它三種疫苗株一樣,K(1ys)和R(Arg)分別由F(Phe)和A(Ala)替代,這兩個(gè)位點(diǎn)的改變大大降低了它們的致病力,成為減毒株。由此可判斷實(shí)驗(yàn)用狂犬病病毒糖蛋白基因可用于本課題的疫苗研究。因此,采用生物信息學(xué)手

9、段分析預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)功能和抗原表位位點(diǎn),為疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)第二階段,構(gòu)建了pYes-G(-SS)和pYes-InG(-SS-TD)兩種重組載體。兩種載體分別采用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母,Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選陽(yáng)性重組子,SDS-PAGE和Western blot分離鑒定目的蛋白等方法,研究了糖蛋白基因在釀酒酵母中的胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)。pYes-G(-SS)胞內(nèi)表達(dá)研究結(jié)果顯示,(1)去除信號(hào)肽的CVS24-G基因在釀酒酵母中表

10、達(dá)的重組蛋白可能以兩種形式存在,分別為yGI66kD和yG Ⅱ 58kD,而Western blot結(jié)果顯示僅yG Ⅱ 58kD可與單克隆抗體結(jié)合,發(fā)生顯色反應(yīng)。結(jié)合其他研究結(jié)果,可以初步認(rèn)為,在釀酒酵母中,CVS24-G蛋白TD區(qū)可能會(huì)影響yGI蛋白中抗原位點(diǎn)的暴露,從而影響它與單克隆抗體的結(jié)合。為驗(yàn)證這一判斷,我們構(gòu)建了去除TD區(qū),但同時(shí)連接菊粉酶信號(hào)肽的融合基因InG,即pYes-InG(-SS-TD)重組載體,并研究了該融合基因

11、在釀酒酵母中的分泌表達(dá)情況。首先,為增強(qiáng)結(jié)果的可比性,分別提取了pYes-G和pYes-InG重組酵母的胞內(nèi)蛋白,SDS-PAGE分析比較發(fā)現(xiàn),去除TD的CVS24-G基因在釀酒酵母中表達(dá)的重組蛋白大小與G(-SS)重組蛋白yG Ⅱ一致,從條帶濃度判斷,表達(dá)量略高于pYes-G重組酵母表達(dá)時(shí)yGⅡ的含量。上清液中分泌蛋白的Westernblot顯示有特異性結(jié)合反應(yīng),大小約58kD,也與yG Ⅱ一致。這一結(jié)果表明TD區(qū)在蛋白質(zhì)的成熟折疊過

12、程中確實(shí)影響了糖蛋白的空間結(jié)構(gòu)和大小。
　　 基于重組微生物進(jìn)入消化道后的治療理論,我們將兩組重組酵母pYes-G和pYes-InG分別灌胃小鼠,通過酵母存活率、免疫組化和血清ELISA等一系列指標(biāo)檢測(cè)驗(yàn)證口服重組活體酵母是否能刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)。
　　 首先,取0.5ml OD600=10.8的任一種高密度重組酵母灌胃小鼠(n=12),分別于消化后8小時(shí)和12小時(shí)采集小鼠小腸組織,稀釋小腸組織的提取液,鋪于孟加拉紅平板

13、上粗略計(jì)算酵母存活率。最終結(jié)果顯示,消化8小時(shí)后酵母存活率最高達(dá)36.11％,12小時(shí)后酵母最高存活率為0.59％,可以判斷重組酵母能抵制消化道內(nèi)的酸、鹽和蛋白酶的破壞作用,在小腸大量定植并存活,這就為重組酵母釋放生物活性物質(zhì)提供了機(jī)會(huì),而這一存活時(shí)間也是檢測(cè)小鼠小腸中是否存在糖蛋白的最佳時(shí)機(jī)。
　　 其次,兩種重組酵母分別灌胃小鼠,灌胃時(shí)間為0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d,并分別于28d,35d,42d灌胃

14、結(jié)束次日采集小鼠血清和小腸組織。免疫組化結(jié)果顯示,口服pYes-InG重組酵母的小鼠小腸組織中,能檢測(cè)到抗原物質(zhì)G蛋白的存在,說明pYes-InG重組酵母在消化道中可以繼續(xù)進(jìn)行分泌表達(dá)。相反,口服pYes-G重組酵母的小鼠小腸組織中,未能檢測(cè)到該抗原物質(zhì),但并不能說明pYes-G重組酵母在消化道體內(nèi)無(wú)法完成釋放,其因?yàn)榭赡苡袃牲c(diǎn),其一,pYes-G重組酵母的表達(dá)量很低,根據(jù)CVS24-G蛋白胞內(nèi)表達(dá)結(jié)果,重組蛋白中僅yGⅡ能與抗體發(fā)生特

15、異性反應(yīng),而這一蛋白僅占重組CVS24-G蛋白總量的1％,少量蛋白釋放后又會(huì)被快速分解,因而導(dǎo)致難以檢測(cè)；其二,盡管pYes-InG重組酵母的重組蛋白表達(dá)量略高于pYes-G重組酵母的yGⅡ蛋白,但因其是分泌表達(dá),酵母可在消化道內(nèi)持續(xù)分泌,直至細(xì)胞自溶破裂,因此及時(shí)的采集小腸組織樣本,進(jìn)行免疫組化反應(yīng),完全有可能檢測(cè)到小腸組織中的狂犬病病毒糖蛋白。但這一外源物質(zhì)能否被小腸M吞噬細(xì)胞識(shí)別,并進(jìn)入淋巴細(xì)胞再循環(huán)過程刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體,還

16、需通過ELISA檢測(cè)小鼠體內(nèi)的抗狂犬病的抗體滴度來判斷。
　　 第三,采集小鼠血液,進(jìn)行ELISA。結(jié)果顯示,口服pYes-InG分泌型重組酵母的小鼠血液中產(chǎn)生了一定滴度的中和性抗體,而口服pYes-G重組酵母的小鼠血液中沒有產(chǎn)生中和性抗體,說明疫苗的免疫效果與外源活性物質(zhì)的釋放有密切關(guān)聯(lián)；同時(shí)這一結(jié)果還表明,重組酵母在腸道分泌的蛋白顆?？梢员恍∧cM細(xì)胞吞噬,并由輸出淋巴管進(jìn)入淋巴再循環(huán)過程,從而引起機(jī)體的免疫應(yīng)答,然后誘導(dǎo)機(jī)體

17、產(chǎn)生抗體。這一結(jié)果確證了本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的分泌型重組酵母可以作為狂犬病疫苗,對(duì)狂犬病起到一定的預(yù)防作用。
　　 另外,ELISA結(jié)果還提示,經(jīng)過5～6次的小鼠免疫接種后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體基本恒定或呈緩慢增加趨勢(shì),說明口服重組酵母疫苗仍為一種多劑量疫苗,需多次接種才有效果,而且抗體產(chǎn)生需要一定的時(shí)間,因此這類疫苗不適合對(duì)突發(fā)性狂犬病傳染進(jìn)行控制或?qū)袢』颊哌M(jìn)行治療。
　　 總之,經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),我們成功構(gòu)建了狂犬病口服疫苗