長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)人員頰粘膜和臍周微生物宏基因組學(xué)研究.pdf

1、背景和目的：
　　遠(yuǎn)海作業(yè)自古以來(lái)就成為人類(lèi)獲得資源、加強(qiáng)聯(lián)系和對(duì)外防御的主要途徑，但由于長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)的特殊性，船員的發(fā)病率高于陸地作業(yè)人員。人體口腔和體表與外界環(huán)境直接接觸，是機(jī)體自身保護(hù)的第一道屏障，也是微生物的主要寄居部位。人體體表和口腔黏膜寄居著數(shù)百到數(shù)千種微生物，包括細(xì)菌，病毒，真菌等微生物種類(lèi)，這些微生物具有特定的種類(lèi)組成，即形成某種微生物生態(tài)系統(tǒng)。共生微生物與宿主共同在進(jìn)化過(guò)程中保持動(dòng)態(tài)平衡，共生微生物參與宿主的代謝和

2、免疫過(guò)程，并且能夠抵抗病原菌定植。大量的臨床研究顯示，微生物群落的變化與宿主疾病相關(guān)。海上特殊環(huán)境如狹小的艙室內(nèi)空氣不夠流暢，氣候潮濕悶熱，清潔用的淡水補(bǔ)給不足等可能會(huì)引發(fā)體內(nèi)和體表微生物群落的改變，影響機(jī)體的代謝、免疫功能從而在一定程度上影響作業(yè)能力。因此從微生物群落結(jié)構(gòu)著手，分析長(zhǎng)遠(yuǎn)航環(huán)境對(duì)體表和口腔微生物組成的影響，進(jìn)一步利用微生物變化來(lái)評(píng)估人體健康狀況，以預(yù)防疾病和維護(hù)健康。
　　宏基因組學(xué)(metagenomics)研究

3、的對(duì)象是特定生物環(huán)境中全部微小生物的基因組，即所有生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因。宏基因組學(xué)基于高通量DNA測(cè)序技術(shù)，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)大規(guī)模測(cè)序結(jié)果分析了解微生物群落中的種群分布和功能基因，克服了傳統(tǒng)微生物分析中絕大多數(shù)微生物難培養(yǎng)的障礙，可直接從自然界獲取遺傳信息，極大拓寬了微生物資源的利用空間，成為目前研究微生物的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物、人體口腔、皮膚及腸道微生物群落組成和功能研究。應(yīng)用宏基因

4、組學(xué)方法研究頰粘膜和臍周微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化，從不同層面分析了微生物群落組成、代謝功能及其對(duì)宿主健康狀況的影響，認(rèn)識(shí)了長(zhǎng)遠(yuǎn)航環(huán)境對(duì)作業(yè)人員健康的影響，為長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)人員健康維護(hù)積累了科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　材料和方法：
　　分別于長(zhǎng)遠(yuǎn)航前后采集19人口腔頰粘膜和臍周微生物樣本，提取微生物基因組DNA后進(jìn)行測(cè)序研究。其中6人12例頰粘膜微生物樣本應(yīng)用Sanger法測(cè)序分析16S rRNA基因全長(zhǎng)，12人48例頰粘膜和臍周微生物樣本

5、應(yīng)用IlluminaMeseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA基因V4區(qū)段進(jìn)行高通量測(cè)序分析，應(yīng)用目前先進(jìn)的后光學(xué)(post-light) DNA測(cè)序平臺(tái)Ion-Torrent PGM系統(tǒng)及Illumina Miseq系統(tǒng)對(duì)1人共4例口腔頰粘膜和臍周微生物樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析;此外，采集此次長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)人員（57人）血液樣本進(jìn)行血常規(guī)血生化檢測(cè)，應(yīng)用臨床常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)不同批次長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)人員血清中葉酸(folate acid，F(xiàn)A)、同型半

6、胱氨酸(homocysteine，HCY)和維生素B12(vitamin B12，VB12)含量。Sanger法測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Genebank中BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析，16S rRNA基因V4區(qū)段測(cè)序結(jié)果應(yīng)用QIIME軟件分析，宏基因組測(cè)序結(jié)果利用成熟的通用生物信息學(xué)分析軟件MG-RAST3.3進(jìn)行生物信息分析。應(yīng)用SPSS19.0軟件比較分析血常規(guī)血生化結(jié)果以及血清中葉酸、同型半胱氨酸和VB12含量。
　　結(jié)果：<

7、br>　　16S rRNA和全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)結(jié)果證明長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期口腔頰粘膜微生物中在門(mén)水平以硬壁菌門(mén)(Firmicutes)為主，在屬水平則以鏈球菌屬(Streptococcus spp.)為主，符合研究報(bào)導(dǎo)，長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期硬壁菌門(mén)和鏈球菌屬的含量進(jìn)一步升高。比較分析長(zhǎng)遠(yuǎn)航前后微生物組成和變化發(fā)現(xiàn)與前期相比后期微生物種類(lèi)發(fā)生較大變化，前后兩個(gè)時(shí)期的微生物趨向于分為兩個(gè)類(lèi)群，長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期微生物

8、種類(lèi)更加集中，結(jié)合16S rRNA和WGS多樣性分析結(jié)果證明后期微生物多樣性下降，比較微生物種類(lèi)變化發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期致病菌和條件致病菌含量升高。應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG)網(wǎng)站對(duì)微生物功能基因注釋分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期微生物參與三大物質(zhì)代謝和葉酸合成代謝的功能基因數(shù)量下降。分析血清中葉酸發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期血清葉酸水平下降，與微生物參與葉酸合成的酶類(lèi)數(shù)量下降這

9、一變化趨勢(shì)正相關(guān)。長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員常規(guī)體檢結(jié)果中粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值下降，平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular haemoglobin concentration，MCHC)下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　長(zhǎng)遠(yuǎn)航前期臍周微生物主要細(xì)菌菌門(mén)為變形菌門(mén)，后期含量下降而硬壁菌門(mén)含量升高成為主要菌門(mén)，細(xì)菌菌屬分析結(jié)果證明前期葡萄球菌屬和棒桿菌屬占主導(dǎo)地位，長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期葡萄球菌屬含量升高，棒桿菌屬含量下降。多樣性分析結(jié)果證明后期臍周微生物

10、多樣性下降，微生物組成及變化分析結(jié)果顯示后期致病菌和條件致病菌含量升高。此外，KEGG分析結(jié)果證明后期微生物代謝活性下降，臍周微生物與頰粘膜微生物變化趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論：
　　長(zhǎng)遠(yuǎn)航前后口腔頰粘膜微生物種類(lèi)發(fā)生較大變化，長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期致病菌和條件致病菌含量升高，結(jié)合臨床指標(biāo)檢查推測(cè)長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)環(huán)境影響頰粘膜微生物組成進(jìn)一步影響作業(yè)人員頰粘膜及全身免疫功能。長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期微生物多樣性下降推測(cè)海洋作業(yè)環(huán)境單一影響微生物保持多樣性狀態(tài)。此

11、外，長(zhǎng)遠(yuǎn)航后微生物葉酸合成活性變化與宿主血清葉酸水平具有正相關(guān)性，提示長(zhǎng)遠(yuǎn)航作業(yè)中共生微生物可反映宿主健康狀況。
　　長(zhǎng)遠(yuǎn)航后期臍周微生物多樣性下降、致病菌、條件致病菌含量升高及代謝活性下降，結(jié)合頰粘膜微生物檢測(cè)結(jié)果推測(cè)長(zhǎng)遠(yuǎn)航環(huán)境能夠影響作業(yè)人員共生微生物，進(jìn)而對(duì)機(jī)體健康造成影響。
　　主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　1.本研究運(yùn)用目前先進(jìn)的DNA二代測(cè)序技術(shù)Ion-Torrent和Illumina系統(tǒng)和先進(jìn)的生物信息學(xué)分析軟件MG

12、-RAST進(jìn)行分析，得到了更完整的頰粘膜及體表微生物種群的種類(lèi)及分布信息。
　　2.分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)遠(yuǎn)航前后頰粘膜及體表微生物多樣性下降、致病菌及條件致病菌含量升高以及微生物代謝功能降低，結(jié)合這些結(jié)果初步探討了長(zhǎng)遠(yuǎn)航環(huán)境對(duì)作業(yè)人員共生菌群的影響，為長(zhǎng)遠(yuǎn)航過(guò)程中作業(yè)人員健康管理積累科學(xué)依據(jù)。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)海上長(zhǎng)遠(yuǎn)航不靠港連續(xù)作業(yè)三月以上，宿主血清葉酸代謝與其口腔頰粘膜共生物菌代謝趨勢(shì)一致，即葉酸代謝通路受阻。海上長(zhǎng)遠(yuǎn)航不定期靠港