基于紅樹林土壤微生物資源研發(fā)的宏基因組學(xué)平臺(tái)技術(shù)的建立與應(yīng)用初探.pdf

1、紅樹林土壤處于“海洋-陸地”界面潮間帶環(huán)境，其生境的獨(dú)特性決定了其中微生物的多樣性及基因資源的珍稀性，深入開展紅樹林土壤微生物的研究將加快新型功能基因、新穎天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程。完全不依賴于平板分離的現(xiàn)代宏基因組學(xué)技術(shù)為充分探索不同自然生境中的微生物資源提供了有力手段。然而，將該技術(shù)實(shí)施于紅樹林土壤微生物的研究時(shí)，尚存在若干困難：①紅樹林土壤為高粘質(zhì)、高有機(jī)質(zhì)含量類型土壤，提取DNA時(shí)存在大量腐殖酸及腐殖酸類等高分子量抑制性物質(zhì)的共提取等

2、問題，造成所得DNA品質(zhì)低下，難于進(jìn)行微生物多樣性分析。②DNA提取過程中，紅樹林土壤中高含量的粘質(zhì)極易吸附剛從微生物細(xì)胞裂解釋放的大片段DNA，造成所得DNA提取物中大片段DNA所占比率低下，難以構(gòu)建大片段宏基因組文庫應(yīng)用于特色微生物資源的“生物探礦”。針對(duì)上述難點(diǎn)，本論文系統(tǒng)開展了紅樹林土壤DNA提取緩沖液的改良與應(yīng)用研究；紅樹林土壤大片段宏基因組文庫構(gòu)建方法的改良與應(yīng)用研究；并針對(duì)現(xiàn)行環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)所存在的“群落結(jié)構(gòu)偏差”和“

3、基因遺漏”等瓶頸，開展了不同裂解方式對(duì)紅樹林土壤不同類型土著微生物細(xì)胞裂解能力的研究；獲得了如下主要研究結(jié)果與結(jié)論： 1.提取土壤DNA時(shí)，緩沖液中的NaCl是決定抑制性物質(zhì)共提取量高低的關(guān)鍵因素之一，隨NaCl濃度的升高，腐殖酸等抑制性物質(zhì)的共提取量明顯下降，而Na3P04對(duì)抑制性物質(zhì)共提取量的影響卻呈現(xiàn)完全相反的規(guī)律；PVP在土壤微生物細(xì)胞裂解前及裂解過程中使用均增加抑制性物質(zhì)的共提取量，裂解后使用反而能提高DNA提取物的品

4、質(zhì)；PVPP在土壤微生物細(xì)胞裂解前及裂解過程中使用均減少抑制性物質(zhì)的共提取量，裂解后使用反而無效；CTAB在土壤微生物細(xì)胞裂解前、裂解過程中及裂解后使用均能提高DNA初提物的品質(zhì)；隨緩沖液中SDS濃度的升高和裂解時(shí)間的延長，抑制性物質(zhì)的共提取量明顯增加；隨緩沖液中CTAB濃度的升高，抑制性物質(zhì)的共提取量逐漸減少，隨裂解時(shí)間的延長，抑制性物質(zhì)的共提取量表現(xiàn)為先增加后減少的規(guī)律；CTAB在緩沖液中使用具有裂解微生物細(xì)胞和去除抑制性物質(zhì)的雙重

5、作用，去除抑制性物質(zhì)的作用占主導(dǎo)地位；PVP、PVPP及CTAB在不同濃度及不同作用方式下使用均不改變環(huán)境樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；提取緩沖液含1.5m0l.L-1INaCl，2％CTAB及2％PVPP時(shí)，所得紅樹林土壤DNA初提物不經(jīng)純化即可成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 2.運(yùn)用本研究改良后的原位裂解提取法能有效提高大片段DNA在總土壤DNA中的比率，該方法與電洗脫純化法聯(lián)用能高效構(gòu)建紅樹林土壤大片段宏基因組文庫。本論文所得4個(gè)季節(jié)紅樹

6、林土壤宏基因組文庫，含9570個(gè)cosmid克隆子，每個(gè)克隆子的平均插入片段均大于35kbp。運(yùn)用功能篩選方法，從該文庫中得到1株具有四環(huán)素抗性的克隆子，1株產(chǎn)褐色色素的克隆子和1株具有淀粉酶活性的克隆子。 3.通過古生菌、細(xì)菌、真菌及放線細(xì)菌特異性引物對(duì)不同裂解方法所得紅樹林土壤DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明：SDS、溶菌酶、液氮凍融、玻璃珠劇烈振蕩、超聲波、微波等6種常規(guī)裂解方式單獨(dú)應(yīng)用均能裂解紅樹林土壤土著細(xì)菌和古生菌，均

7、不能裂解紅樹林土壤土著放線細(xì)菌和真菌；SDS、溶菌酶及玻璃珠劇烈振蕩等3種方法聯(lián)用時(shí)能裂解紅樹林土壤土著真菌；SDS、溶菌酶、玻璃珠劇烈振蕩及微波等4種方法聯(lián)用時(shí)能裂解紅樹林土壤土著放線細(xì)菌。 4.運(yùn)用DGGE方法比較上述6種裂解方式捕捉紅樹林土壤土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息的能力，結(jié)果顯示：沒有1種裂解方式能獲得完整的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息；超聲波、微波裂解法所得紅樹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與溶菌酶裂解法所得結(jié)果相似；其它4種裂解法所得紅樹林土壤