農桿菌介導的大豆子葉節(jié)法體系優(yōu)化及大豆中一個WRKY28-like基因的克隆與功能分析.pdf

1、大豆遺傳轉化是研究基因功能、培育新品種的一個重要手段，目前常采用農桿菌介導的子葉節(jié)轉化法來將外源基因導入大豆品種內，該方法具有拷貝數(shù)目低、遺傳穩(wěn)定性較高等優(yōu)點，但同時也具有基因型依賴性強、伸長率低、篩選困難、褐化現(xiàn)象嚴重、周期長等缺點。Baby Boom(BBM)是一個胚胎發(fā)生相關的基因，可以促進細胞增殖和胚胎發(fā)生，在組織培養(yǎng)條件下能促進誘導再生。研究表明在煙草、毛白楊、甜椒等植物中異位表達BBM可以促進轉化效率的提高。因此，本研究擬通

2、過在大豆中高表達BnBBM基因以提高大豆的再生率和轉化率;此外，對大豆子葉節(jié)轉化過程中的受體基因型、外植體擺放方式、篩選劑濃度、抗氧化劑AgNO3和抗壞血酸Vc的濃度做了比較實驗，希望可以優(yōu)化該轉化體系，提高大豆外植體的再生率和最終的轉化效率。
　　農桿菌介導的子葉節(jié)轉化法體系優(yōu)化的結果如下:①以天隆一號為受體，獲得過表達BnBBM基因（35S啟動子）的T0代轉基因株系1株，其T0代和T1代檢測均為陽性，現(xiàn)已收獲666粒T2代種子

3、。關于BnBBM是否可以提高大豆子葉節(jié)外植體的再生和轉化效率有待今后進一步驗證。②通過比較不同基因型共培養(yǎng)階段的GUS瞬時表達率，明確了天隆一號、Jack紫、大粒黃等為侵染效率高的大豆品種，都高達94％以上。③發(fā)現(xiàn)外植體切口向上擺放可以顯著提高子葉節(jié)GUS基因的表達量，Jack紫品種外植體切口向上時，子葉節(jié)點染色深的概率為11.6％，顯著大于向下時的6.8％;天隆一號品種向上擺放時的染色深概率為63.4％，也顯著大于向下時的44.6％。

4、④篩選劑草丁膦的濃度梯度實驗結果發(fā)現(xiàn)，草丁膦濃度為7 mg·L-1時綜合效果最好。⑤繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度的Vc或AgNO3實驗表明，Vc和AgNO3雖未能明顯改善外植體的褐化情況，但卻顯著地提高了伸長率和轉化效率，添加Vc可使伸長率從7.9％提高到30％,添加AgNO3可以使轉化效率從3.2％提高到5.5％。
　　WRKY家族參與調節(jié)植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫應答等多種過程，AtWRKY28是植物抵抗病原菌和某些非生物逆境

5、所必需的轉錄因子。為探討大豆中一個AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like（Glyma14g03280.1）的生物學功能，本文對該基因進行了克隆、生物信息學分析、亞細胞定位、組織表達等試驗，還對其在ABA、PEG、NaCl脅迫下的表達水平進行了分析，并將GmWRKY28-like轉入模式植物擬南芥中，研究了該基因異位表達時的表型變化。
　　結果顯示:①Gm WRKY28-like基因的編碼區(qū)(CDS)為1008 bp，編

6、碼335個氨基酸。②GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY結構域，含有22個絲氨酸(Serine)、1個蘇氨酸(Threonine)、2個酪氨酸(Tyrosine)，不含跨膜結構與信號肽。③進化樹分析表明與其它植物中的WRKY28蛋白相比，大豆GmWRKY28-like與菜豆WRKY28的相似性最高。④亞細胞定位顯示GmWRKY28-like定位在細胞核中。⑤該基因在根、種子中表達量很低，在真葉、花、及莖尖表達量較高。⑥GmW