矮化大豆GmEXPA41基因的克隆及功能分析.pdf

1、大豆是世界五大作物之一，是非常重要的植物蛋白質(zhì)和食用油資源，也是重要的優(yōu)質(zhì)工業(yè)原料，大豆的綜合利用和開(kāi)發(fā)受到了世界各國(guó)重視。然而，近年來(lái)我國(guó)大豆生產(chǎn)卻增長(zhǎng)緩慢，已經(jīng)不能滿足國(guó)內(nèi)大豆需求。為解決這一矛盾，必須提高大豆產(chǎn)量、優(yōu)化大豆種植，而矮化大豆的研究有利于優(yōu)勢(shì)大豆的種植、提高大豆的產(chǎn)量，滿足中國(guó)大豆日益增長(zhǎng)的需求量。而許多文獻(xiàn)表明，膨脹素(expansin)基因可能與植株的高矮相關(guān)，所以對(duì)矮化大豆expansin的研究有利于我們?cè)诜肿铀?/p>

2、平上研究大豆表型的成因，為大豆的分子育種奠定基礎(chǔ)。
　　 本文克隆了矮化大豆的膨脹素GmEXPA41基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行信息學(xué)分析，最后將矮化大豆的expansin基因構(gòu)建到了大腸桿菌的表達(dá)載體pET32a中，轉(zhuǎn)化到了大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行了原核表達(dá)，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，篩選了高產(chǎn)菌株，并借助發(fā)酵罐對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，為后期矮化大豆膨脹素的分離純化、結(jié)構(gòu)解析和功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：⑴通過(guò)序列比對(duì)設(shè)

3、計(jì)了矮化大豆膨脹素基因的保守區(qū)引物，利用PCR技術(shù)克隆得到了765bp的膨脹素基因的CDS。再通過(guò)5’RACE和3’RACE進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別得到804bp和828bp的基因，最后將三段基因進(jìn)行拼接獲得了矮化大豆GmEXPA41mRNA的全長(zhǎng)序列。通過(guò)NCBI中的blast比較，發(fā)現(xiàn)該序列為新序列，將其提交genebank，得到登陸號(hào)為JF694991。⑵膨脹素GmEXPA41基因進(jìn)行分析表明，基因的CDS大小為765bp，共編碼254

4、個(gè)氨基酸。與正常大豆氨基酸序列的同源性為96.47％。進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)矮化大豆的膨脹素蛋白比正常大豆的膨脹素蛋白多了一個(gè)α螺旋。通過(guò)計(jì)算機(jī)同源模型獲得了矮化大豆以及正常大豆膨脹素蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)矮化大豆的膨脹素蛋白比正常大豆的膨脹素蛋白的β折疊要略少一些。另外，以正常大豆expansin蛋白為受體進(jìn)行了分子對(duì)接模擬，找到與正常大豆的膨脹素蛋白結(jié)合較好的10個(gè)化合物，并模擬了它們的結(jié)合方式，初步研究了一些化合物與膨脹素

5、蛋白的相互作用。⑶構(gòu)建了大腸桿菌重組菌[pET32a-expansin BL21(DE3)]，并且得到了高效表達(dá)菌株2號(hào)。⑷利用高效表達(dá)2號(hào)菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行試管和三角瓶培養(yǎng)，然后以10％的接種量轉(zhuǎn)接到3L的發(fā)酵罐中，溫度為37度，初始轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為150L·h-1。經(jīng)過(guò)3h培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)速與溶氧量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，當(dāng)A600為15時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體，最終發(fā)酵得到菌體濕重94.6