矮化大豆GmEXPA41基因的克隆及功能分析.pdf

1、大豆是世界五大作物之一，是非常重要的植物蛋白質(zhì)和食用油資源，也是重要的優(yōu)質(zhì)工業(yè)原料，大豆的綜合利用和開發(fā)受到了世界各國重視。然而，近年來我國大豆生產(chǎn)卻增長緩慢，已經(jīng)不能滿足國內(nèi)大豆需求。為解決這一矛盾，必須提高大豆產(chǎn)量、優(yōu)化大豆種植，而矮化大豆的研究有利于優(yōu)勢大豆的種植、提高大豆的產(chǎn)量，滿足中國大豆日益增長的需求量。而許多文獻表明，膨脹素(expansin)基因可能與植株的高矮相關(guān)，所以對矮化大豆expansin的研究有利于我們在分子水

2、平上研究大豆表型的成因，為大豆的分子育種奠定基礎(chǔ)。
　　 本文克隆了矮化大豆的膨脹素GmEXPA41基因的全長序列，對其進行信息學(xué)分析，最后將矮化大豆的expansin基因構(gòu)建到了大腸桿菌的表達載體pET32a中，轉(zhuǎn)化到了大腸桿菌BL21(DE3)中，進行了原核表達，經(jīng)過SDS-PAGE分析，篩選了高產(chǎn)菌株，并借助發(fā)酵罐對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，為后期矮化大豆膨脹素的分離純化、結(jié)構(gòu)解析和功能驗證奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：⑴通過序列比對設(shè)

3、計了矮化大豆膨脹素基因的保守區(qū)引物，利用PCR技術(shù)克隆得到了765bp的膨脹素基因的CDS。再通過5’RACE和3’RACE進行PCR擴增分別得到804bp和828bp的基因，最后將三段基因進行拼接獲得了矮化大豆GmEXPA41mRNA的全長序列。通過NCBI中的blast比較，發(fā)現(xiàn)該序列為新序列，將其提交genebank，得到登陸號為JF694991。⑵膨脹素GmEXPA41基因進行分析表明，基因的CDS大小為765bp，共編碼254

4、個氨基酸。與正常大豆氨基酸序列的同源性為96.47％。進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)矮化大豆的膨脹素蛋白比正常大豆的膨脹素蛋白多了一個α螺旋。通過計算機同源模型獲得了矮化大豆以及正常大豆膨脹素蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)矮化大豆的膨脹素蛋白比正常大豆的膨脹素蛋白的β折疊要略少一些。另外，以正常大豆expansin蛋白為受體進行了分子對接模擬，找到與正常大豆的膨脹素蛋白結(jié)合較好的10個化合物，并模擬了它們的結(jié)合方式，初步研究了一些化合物與膨脹素

5、蛋白的相互作用。⑶構(gòu)建了大腸桿菌重組菌[pET32a-expansin BL21(DE3)]，并且得到了高效表達菌株2號。⑷利用高效表達2號菌株為出發(fā)菌株，進行試管和三角瓶培養(yǎng)，然后以10％的接種量轉(zhuǎn)接到3L的發(fā)酵罐中，溫度為37度，初始轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為150L·h-1。經(jīng)過3h培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)速與溶氧量進行關(guān)聯(lián)，當A600為15時，加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體，最終發(fā)酵得到菌體濕重94.6