基于高通量測(cè)序技術(shù)的枯草芽孢桿菌在體動(dòng)態(tài)變化研究.pdf

1、研究背景:
　　腸道菌群在腸穩(wěn)態(tài)維持和腸易激綜合征(IBS)等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)腹瀉性IBS患者短期應(yīng)用益生菌治療可以調(diào)節(jié)異常的小腸粘膜的屏障功能，改善患者的腹痛和腹脹癥狀，并降低患者的總IBS癥狀評(píng)分。然而益生菌攝入后如何在腸道內(nèi)定植以及如何影響腸道微生態(tài)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了“示蹤基因”，并應(yīng)用16SrDNA高通量測(cè)序技術(shù)定量分析益生菌和腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化。
　　目前對(duì)腸道微生物群的研究多應(yīng)用

2、傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳DGGE，這些方法具有一定的局限性。而Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度，滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序方法探究益生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)腸道微生物群豐度和多樣性的影響，并將高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)——實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3、進(jìn)行比較，進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)在定量示蹤益生菌時(shí)的優(yōu)越性。
　　目的:
　　探討枯草芽孢桿菌在腸道內(nèi)的定植情況及其服用時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)小鼠腸道菌群的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建示蹤基因:定量探究益生菌攝入后在腸道中的動(dòng)態(tài)變化。為將攝入的益生菌與腸道固有菌群區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分使用的B.subtilis擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的338-806區(qū)域，上下游引物分別為338F-5' ACTCCTACGGGAGGCAGC

4、A，806R-5' GGACTACHVGGGTWTCTAAT。經(jīng)此示蹤基因標(biāo)記的益生菌在16SrDNA測(cè)序過程中會(huì)得到獨(dú)有的循環(huán)序列，其豐度代表攝入干預(yù)益生菌B.subtilis的量，以此定量示蹤益生菌在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):18只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成三組(n=6)，分別為對(duì)照組（C組），兩天組(TW組)和十天組(TE組)，C組從第0天到第9天以0.9％生理鹽水2 ml每天灌胃。TW組在第0天至第1天以B.s

5、ubtilis109 CFU/ml菌體懸液2 ml每天灌胃，第2天至第9天則以0.9％生理鹽水2 ml每天灌胃。TE組從第0天至第9天以B.subtilis109CFU/ml菌體懸液2 ml每天灌胃。三組小鼠均分別在第0天、第4天、第8天、第12天、第16天和第20天收集糞便并保存于-80℃冰箱。提取DNA后通過Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，分析腸道菌群中各種門、屬細(xì)菌的相對(duì)豐度及其變化規(guī)律，同時(shí)分析測(cè)序結(jié)果中示蹤基因

6、的相對(duì)豐度及其變化規(guī)律，代表攝入后益生菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化，探究腸道微生態(tài)環(huán)境對(duì)益生菌的作用規(guī)律。同時(shí)進(jìn)行16SrDNA熒光定量PCR，將高通量測(cè)序和定量PCR兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　1.灌胃后TW組和TE組的芽孢桿菌屬微生物相對(duì)豐度與灌胃前相比下降。
　　2.各組內(nèi)腸道菌群相對(duì)豐度隨時(shí)間變化規(guī)律為:厚壁菌門和擬桿菌的變化規(guī)律不明顯，在益生菌灌胃的過程中呈反復(fù)波動(dòng)的趨勢(shì)，在第20天時(shí)穩(wěn)定在十天組和兩天組較

7、對(duì)照組的厚壁菌門相對(duì)豐度更高;隨著時(shí)間的變化兩天組和十天組內(nèi)變形菌門的相對(duì)豐度較實(shí)驗(yàn)組更低;疣微菌門出現(xiàn)了顯著的而有規(guī)律性的變化:在第4天時(shí)TW組內(nèi)的疣微菌門相對(duì)豐度開始較C組更高，但較TE組更低，其后隨著時(shí)間變化一直穩(wěn)定這種趨勢(shì)，在第16天時(shí)出現(xiàn)短暫的高于TE組，但在第20天時(shí)相對(duì)豐度回落。而TE組內(nèi)的疣微菌門相對(duì)豐度始終高于C組和TW組。
　　3.TE組在除了第0天的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，而TW組在這各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸