甘油脫水酶基因的克隆表達及分子改性.pdf

1、1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一種重要的化工原料，采用生物法制取1，3-PD的開發(fā)與研究在國內(nèi)外受到越來越廣泛的關(guān)注。甘油脫水酶是生物法代謝生產(chǎn)1，3-PD的關(guān)鍵酶和限速酶，因此對其的研究顯得尤為重要。該文首先克隆表達了甘油脫水酶及其相關(guān)酶的基因，研究了它們的酶學性質(zhì)，并從理性和非理性角度對甘油脫水酶進行了分子改造，利用同源建模構(gòu)建了相關(guān)酶的三維結(jié)構(gòu)，并利用三維結(jié)構(gòu)信息分析探討了三維結(jié)構(gòu)和酶學性質(zhì)之間的

2、關(guān)系。主要取得結(jié)果如下：
　　 1甘油脫水酶及其相關(guān)基因的克隆表達、酶學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究
　　 (1)克隆并高效表達了弗氏檸檬酸菌的甘油脫水酶基因dhaBCE，純化后測定了該酶的酶學性質(zhì)。并通過同源建模獲得了該重組酶的三維結(jié)構(gòu)信息，預(yù)測了該酶的活性中心。
　　 (2)克隆并高效表達了克雷伯氏菌的甘油脫水酶基因gldABC，純化后測定了該酶的酶學性質(zhì)。并通過同源建模獲得了該重組酶的三維結(jié)構(gòu)信息，預(yù)測了該酶的活性中心。

3、
　　 (3)從甘油富集菌的宏基因組中克隆表達了一個基因，并確定為甘油脫水酶基因。通過同源建模獲得了該酶的三維結(jié)構(gòu)信息，活性中心的與底物結(jié)合的6個氨基酸殘基中的Asp336位(位于大亞基)變?yōu)榱薌ly336，底物與周圍氨基酸氨基之間的氫鍵與其它的甘油脫水酶相比均發(fā)生了變化，初步分析可能是造成此甘油脫水酶沒有活力的原因。
　　 (4)克隆并高效表達了弗氏檸檬酸菌的1，3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT。純化后測定了該酶的酶學

4、性質(zhì)。并通過同源建模構(gòu)建了其三維結(jié)構(gòu)并分析了結(jié)構(gòu)特征。
　　 (5)通過over-lap PCR方法將甘油脫水酶基因dhaBCE和1，3-丙二醇氧化還原酶dhaT因首尾相連，構(gòu)成一個多順反子，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的協(xié)同表達，液相和氣相色譜均顯示有1,3-PD的產(chǎn)生和積累。
　　 (6)克隆并協(xié)同表達了弗氏檸檬酸菌甘油脫水酶的激活因子基因dhaF和dhaG，純化后研究其激活性質(zhì)表明：此激活因子不但可以激活本身的甘油脫水酶，而

5、且還可以交叉激活克雷伯氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌兩個不同種屬的甘油脫水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脫水酶；并通過同源建模方法構(gòu)建了該激活因子的三維結(jié)構(gòu)。
　　 (7)克隆并協(xié)同表達了克雷伯氏菌甘油脫水酶的激活因子基因gdrA和gdrB。純酶的激活實驗表明，此激活因子不但可以激活本身的甘油脫水酶，而且還可以交叉激活弗氏檸檬酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌兩個不同種屬的甘油脫水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脫水酶；并通過同源建模方法構(gòu)建了該激活因子的三

6、維結(jié)構(gòu)。
　　 2甘油脫水酶高通量篩選體系
　　 采用雙層指示平板，根據(jù)直觀的顏色反應(yīng)，建立了一套甘油脫水酶的高通量的篩選方法，篩選在非正常條件下(酸性、堿性和高溫等)的突變酶，該方法可以大大降低背景的影響，簡捷、高效。
　　 3甘油脫水酶的定向進化
　　 (1)以五種不同種屬來源的甘油脫水酶基因為材料，利用DNaseI和內(nèi)切酶結(jié)合法進行familiy shuffling，雖然沒有篩選到酶學性質(zhì)得到改善的

7、突變子，但序列分析顯示基因間發(fā)生了強烈的重組，實驗為familyshuffling的繼續(xù)開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 (2)通過error-prone PCR方法對克雷伯氏菌的甘油脫水酶基因進行隨機突變研究，得到了穩(wěn)定性明顯改善的兩個突變酶，GDHtKP5-2和GDHtKP6-1，其中GDHtKP6-1在pH6.0條件下的半衰期是野生酶的16倍，并且45℃和50℃時的穩(wěn)定性得到了明顯的提高，45℃時的半衰期大約是野生酶的6倍。通過同源

8、建模初步分析了野生型和突變型GDHt在三維結(jié)構(gòu)上的差異；并通過能量計算，探討了它們酶學性質(zhì)差異的原因。
　　 4甘油脫水酶的理性設(shè)計
　　 (1)通過能量的理性設(shè)計，對來自于弗氏檸檬酸菌、克雷伯氏菌和宏基因組的甘油脫水酶的大、中-小亞基進行了異源亞基之間的雜合改組，結(jié)果表明：部分雜合酶具有活力，其酶學性質(zhì)也得到明顯改善。雜合酶GDHt(KU)使來源于宏基因組的本沒有活力的甘油脫水酶獲得了活力，雖然比活力比較低，但其熱穩(wěn)定

9、性得到了非常明顯的提高；另外，雜合酶GDHt(CK)和GDHt(KC)在酸性條件下的穩(wěn)定性均得到了明顯的提高。最后，通過同源建模初步分析了野生型和雜合型甘油脫水酶在三維結(jié)構(gòu)上的差異，并探討了它們酶學性質(zhì)差異的原因。
　　 (2)通過PoPMuSiC理性設(shè)計，對克雷伯氏菌甘油脫水酶進行了定點突變，結(jié)果顯示：突變體的酸堿穩(wěn)定性有較明顯的改善，突變體GDHtKP525在酸堿條件下的半衰期提高了約1.5～2倍；GDHtKP60在堿性條件

10、下的穩(wěn)定性得到了提高。通過同源建模初步分析了野生型和突變型甘油脫水酶在三維結(jié)構(gòu)上的差異，并探討了它們酶學性質(zhì)差異的原因。
　　 (3)結(jié)合ProSa理性設(shè)計，對弗氏檸檬酸菌甘油脫水酶進行飽和突變研究，結(jié)果顯示：突變體的酶學性質(zhì)有一定程度的改善，突變體283-2-1和283-3-3的Km值均有一定程度的升高，突變體283-2-1的Km值明顯變大，約是野生酶的2～3倍。突變體297-6-12的Km值明顯變小，約是野生酶1/3～5；突

11、變體297-6-11的Km值雖有升高但不明顯，而Vmax值提高比較明顯，約是野生酶的2～3倍，其中對甘油的Vmax值提高了約3.3倍。而α222位點的突變體的酶學性質(zhì)均沒有得到改善。通過同源建模初步分析了野生型和突變型甘油脫水酶在三維結(jié)構(gòu)上的差異，并探討了它們酶學性質(zhì)差異的原因。
　　 據(jù)我們所知，有關(guān)甘油脫水酶理性和非理性分子改性的系統(tǒng)研究，在國內(nèi)外均無報道，我們是首次開辟了這一領(lǐng)域的研究。本研究為國內(nèi)外深入了解甘油脫水酶性質(zhì)