具細胞毒活性海洋微生物的分離篩選及次級代謝物研究.pdf

1、號稱第二號“殺手”的腫瘤疾病嚴重威脅著人類的生命健康，對其仍無醫(yī)治良方。在治療癌癥方面，天然來源藥物發(fā)揮著重要的延年益壽作用。自20世紀40年代從一株點青霉(Penicilliumnotatum)中發(fā)現(xiàn)青霉素后，陸地微生物，尤其是鏈霉菌屬，因它們能產生豐富的且具有一定生物活性作用的次級代謝物而受到廣泛關注。經過幾十年的大量開發(fā)，從陸地微生物中開發(fā)到新型次級代謝產物的幾率已大為降低，因此科學家們將目光投向了占陸地表面積達70％以上的海洋環(huán)

2、境，期待從中能開發(fā)到具新型結構的化合物。生活在海洋環(huán)境當中的海洋微生物種類繁多，且因生存環(huán)境獨特(高壓、高鹽和高溫等)而能夠產生結構新穎、功能獨特的次級代謝物。因此，本論文開展了從海洋微生物次級代謝產物中篩選具細胞毒作用的先導化合物的研究工作。 本文對從海南島近海區(qū)采集的59個樣品，通過采用IM、GS、SC、GA、M1、YE、GN、HV、CZ和MT等10種分離培養(yǎng)基和加熱、SDS、苯酚、幾丁質富集和YE富集等5種預處理方法，共分

3、離到1409株海洋微生物菌株，其中細菌962株，絲狀真菌168株，放線菌279株。同時發(fā)現(xiàn)，采用加熱和SDS等2種預處理方法和GS、SC和YE等3種培養(yǎng)基有利于放線菌的分離。本研究對MTT法和稻瘟霉孢子法這兩種篩選模型對海洋微生物細胞毒活性菌株篩選的相關性進行了比較，以確定出稻瘟霉孢子法能否作為本實驗室的細胞毒藥物快速篩選方法。結果表明，當采用稻瘟霉孢子法作初篩時，假陽性率可達26.26％，且會漏篩掉一半以上的細胞毒活性菌株，因此不適合

4、作為細胞毒活性菌株的初篩模型。采用MTT法對篩選分離得到的1409株海洋微生物菌株的發(fā)酵液進行了初步篩選后共獲得208株活性菌株，其中細菌的陽性率為12.75％，放線菌為22.10％，真菌為14.29％。 在本研究中對分離獲得的對白血病細胞系K562具強細胞毒活性(ID50]1000)的3株鏈霉菌050642、060386和060524等菌株進行了生理生化性狀的初步研究，結果表明3株菌遺傳穩(wěn)定性好，均有一定的開發(fā)價值。利用硅膠柱

5、層析、反相Ci8柱層析和SephadexLH-20等層析分離手段，通過活性跟蹤法對具強細胞毒活性的鏈霉菌菌株060524的次級代謝物進行了分離，同時利用質譜(ESI-MS或EI-MS)、核磁共振(1HNMR、13C-NMR、DEPT和NOED)等波譜技術對分離獲得的化合物進行了結構鑒定，共分離鑒定獲得了13個化合物，其中分離得到了大豆素、染料木素、3’-羥基大豆素、3’-羥基染料木素和benzaldehyde等5個具弱抗腫瘤活性的化合物

6、(20μg/ml≤IC50≤50μg/m1)；1-H-3-吲哚羧酸和1-H-3-吲哚羧酸甲酯等2個具中強細胞毒活性的化合物(10μg/ml≤IC50≤20μg/ml);anisomycin和deacetylanisomycin等2個具強細胞毒性的茴香霉素類抗腫瘤抗生素(IC50≤10μg/m1)。同時在90μg/ml的藥物作用濃度時，l-H-3-吲哚羧酸和deacetylanisomycin均顯示了細胞凋亡作用。 本文還對鏈霉菌