氧化應(yīng)激調(diào)控基因p66shc對(duì)肝細(xì)胞衰老的影響及其在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、研究背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率與日俱增，已成為最常見(jiàn)的慢性肝病之一，它不再是人們傳統(tǒng)觀念中的良性疾病，也可以向終末期肝病進(jìn)展，因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全明確，最近研究表明細(xì)胞衰老與NAFLD密切相關(guān)，可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。細(xì)胞衰老是細(xì)胞脫離正常周期不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，

2、主要表現(xiàn)在衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)活性的增高、細(xì)胞形態(tài)的變化、細(xì)胞周期的改變、端粒縮短及衰老基因p53、p21、p16等的表達(dá)增加，另外細(xì)胞在衰老過(guò)程中，生物活性因子如粘附因子及炎性因子等分泌增多，這些變化都可能對(duì)細(xì)胞功能造成影響而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD中存在肝細(xì)胞衰老現(xiàn)象，表現(xiàn)為過(guò)早的端?？s短、細(xì)胞核增大、p21表達(dá)增加;且端?？s短

3、、p21表達(dá)增加等細(xì)胞衰老現(xiàn)象與纖維化程度及疾病進(jìn)展不良后果肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)等相關(guān)。細(xì)胞衰老極可能是誘導(dǎo)及促進(jìn)NAFLD的重要作用分子靶點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞衰老相關(guān)機(jī)制及分子信號(hào)通路的研究為NAFLD的防治提供了重要線索。
　　NAFLD和衰老有著共同的機(jī)制-氧化應(yīng)激，目前認(rèn)為NAFLD狀態(tài)下，線粒體過(guò)度產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以促進(jìn)肝細(xì)胞損傷

4、;同時(shí)，氧化應(yīng)激可通過(guò)DNA損傷、端粒縮短以及直接調(diào)控衰老相關(guān)信號(hào)通路等多種途徑引起細(xì)胞衰老，可能是導(dǎo)致NAFLD肝細(xì)胞衰老的直接原因，但確切機(jī)制尚不明確。線粒體銜接蛋白p66shc是Shc家族成員中的一員，是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的重要調(diào)控者，在線粒體ROS形成中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，p66shc是一種重要的調(diào)控細(xì)胞衰老的蛋白，其在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞衰老過(guò)程中起重要作用，參與了心臟損傷、糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)

5、激調(diào)控基因p66shc是否為調(diào)控肝細(xì)胞衰老并參與NAFLD疾病進(jìn)展的重要原因機(jī)制仍有待闡明，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究有望為NAFLD的防治提供一個(gè)新的方法。
　　目的:觀察NAFLD中細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)志物及p66shc的表達(dá)，并分析相關(guān)性，探討細(xì)胞衰老與p66shc的關(guān)系及在疾病進(jìn)展中的作用;進(jìn)一步敲低及過(guò)表達(dá)p66shc后，觀察細(xì)胞衰老及脂肪變的變化，研究p66shc與細(xì)胞衰老的因果關(guān)系及對(duì)疾病的影響。
　　研究方法:1、選取NA

6、FLD患者外周血標(biāo)本100例，肝組織標(biāo)本37例，及正常入外周血標(biāo)本100例，通過(guò)real-time PCR的方法檢測(cè)外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度(leucocyte telomere length，LTL)的變化，免疫組化的方法檢測(cè)肝組織p21、p66shc的表達(dá)，分析細(xì)胞衰老指標(biāo)與p66shc表達(dá)的相關(guān)性及其與疾病進(jìn)展的聯(lián)系;
　　2、SD大鼠20只，隨機(jī)分為高脂飲食組（10只）和正常對(duì)照組（10只），高脂高膽固醇飲食構(gòu)建NAFLD模型

7、，8周后處死，檢測(cè)肝組織p66shc及衰老指標(biāo)p53、p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X、SA-β-gal等的表達(dá)，并分析相關(guān)性，在NAFLD大鼠模型中進(jìn)一步探討細(xì)胞衰老與p66shc的關(guān)系;
　　3、體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株(hepG2)，采用雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型，檢測(cè)p66shc及衰老指標(biāo)p53、p21、p16、SA-β-gal等的表達(dá)及細(xì)胞脂肪變的變化，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA敲低p66shc，觀察對(duì)衰老

8、指標(biāo)p21、SA-β-gal及脂肪變的影響;此外，常規(guī)培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株（L-02），p66shc過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞后，觀察衰老指標(biāo)p21、SA-β-gal及細(xì)胞脂肪變的變化，在體外研究p66shc與細(xì)胞衰老的因果關(guān)系及對(duì)脂肪變的影響。
　　結(jié)果:1、與對(duì)照組比較，NAFLD患者LTL明顯縮短，并與肝組織p21表達(dá)明顯相關(guān)，且兩者與肝臟纖維化程度顯著相關(guān)(p＜0.05);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)p21表達(dá)及LTL變化與p66shc的

9、表達(dá)顯著相關(guān)(p＜0.05)，且p66shc與肝組織脂肪變及纖維化顯著相關(guān)(p＜0.05)。
　　2、SD大鼠高脂高膽固醇飲食8周可成功構(gòu)建NAFLD模型，與對(duì)照組比較，高脂高膽固醇飲食組大鼠體重明顯增加，血清ALT、AST及血脂等明顯升高，肝臟顯著增大且脂肪變炎癥明顯加重(p＜0.05);NAFLD組大鼠肝組織p66shc及衰老指標(biāo)p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X及SA-β-gal的表達(dá)明顯增多(p＜0.05)，且衰老

10、指標(biāo)與p66shc的表達(dá)顯著相關(guān)(p＜0.05)。
　　3、雙氧水處理hepG2細(xì)胞后可成功誘導(dǎo)衰老模型，與對(duì)照組比較，雙氧水處理組衰老指標(biāo)p21、p16、SA-β-gal的表達(dá)明顯增多，且p66shc的表達(dá)明顯升高并與衰老指標(biāo)表達(dá)顯著相關(guān)，細(xì)胞脂肪變程度加重(p＜0.05);進(jìn)一步慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA敲低p66shc后，p66shc表達(dá)明顯降低，且敲低p66shc對(duì)雙氧水刺激引起的hepG2細(xì)胞衰老有保護(hù)作用，與未敲低組比較，衰

11、老指標(biāo)p21、SA-β-gal的表達(dá)明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂肪變程度減輕(p＜0.05);p66shc過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，L-02細(xì)胞中p66shc表達(dá)明顯增多，衰老指標(biāo)p21及SA-β-gal的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞脂肪變程度加重(p＜0.05)。
　　結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NAFLD中細(xì)胞衰老指標(biāo)及p66shc表達(dá)增高，且兩者具有顯著相關(guān)性，提示細(xì)胞衰老與p66shc聯(lián)系密切，并可能參與了NAFLD疾病的發(fā)生發(fā)展;體外