IRX3在非酒精性脂肪性肝病和肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 Irx3促進(jìn)肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變的研究
　　目的：研究Irx3在肝內(nèi)脂質(zhì)代謝中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：通過尾靜脈注射過表達(dá)或沉默Irx3的腺病毒及對(duì)照腺病毒的方法，在小鼠體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)Irx3的表達(dá)，并給予正?；蚋咧嬍?2周，檢測(cè)小鼠肝組織學(xué)變化、脂質(zhì)蓄積情況及脂滴相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染Irx3過表達(dá)腺病毒或?qū)φ障俨《镜男∈蟾渭?xì)胞中，下調(diào)Fsp27β或Perilipin1的表達(dá)，并給予400μmol

2、/l油酸誘導(dǎo)，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。此外，我們使用染色質(zhì)免疫共沉淀和報(bào)告基因熒光素酶檢測(cè)等分子生物學(xué)的方法，研究Irx3是否能夠轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β或Perilipin1的表達(dá)。
　　結(jié)果：上調(diào)肝內(nèi) Irx3的表達(dá)可促進(jìn)肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變，以及增加 Fsp27β和Perilipin1的表達(dá)；相反，下調(diào)肝內(nèi)Irx3的表達(dá)可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變，降低Fsp27β和Perilipin1的表達(dá)水平。但是脂滴相關(guān)蛋白Cidea

3、、Cideb、Atgl、Cgi-58和Perilipin2-4的表達(dá)不受Irx3表達(dá)變化的影響。與對(duì)照腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞相比，Irx3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加，但是在腺病毒介導(dǎo)的Irx3過表達(dá)的肝細(xì)胞內(nèi)下調(diào)Fsp27β或Perilipin1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著性降低。染色質(zhì)免疫共沉淀和報(bào)告基因熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，Irx3能與Fsp27β和Perilipin1的基因啟動(dòng)子片段結(jié)合，而過表達(dá)Irx3增強(qiáng)Fsp2

4、7β和Perilipin1的基因啟動(dòng)子報(bào)告基因的熒光素酶活性。
　　結(jié)論：Irx3通過轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β和Perilipin1的表達(dá)，促進(jìn)肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變。
　　第二部分 IRX3在肝細(xì)胞癌中的作用及表達(dá)調(diào)控研究
　　目的：研究IRX3在肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）中的作用，并從miRNA的角度探討其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：采用qRT-PCR和Western bl

5、ot方法檢測(cè)HCC細(xì)胞系（HepG2和SMMC7721）和永生化肝細(xì)胞系LO2中IRX3和miR-377表達(dá)水平；慢病毒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞構(gòu)建IRX3穩(wěn)定表達(dá)和沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-shIRX3和SMMC7721-IRX3；采用CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和克隆形成能力；采用劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；將miR-377 mimics或Control mimics轉(zhuǎn)染入HCC細(xì)胞，QRT-PC

6、R和Western blot方法檢測(cè)miR-377對(duì)IRX3的調(diào)控作用；運(yùn)用報(bào)告基因技術(shù)證實(shí)miR-377是否可直接結(jié)合IRX33’UTR；將miR-377 mimics轉(zhuǎn)染入SMMC7721-IRX3細(xì)胞，CCK8、克隆形成、劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miR-377是否能拮抗IRX3對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。
　　結(jié)果：HepG2和SMMC7721細(xì)胞中IRX3 mRNA和蛋白水平均顯著高于LO2細(xì)胞；CCK-8實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，上調(diào)IRX3顯著提高了SMMC7721細(xì)胞的生長(zhǎng)，而下調(diào)IRX3抑制了HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，SMMC7721-IRX3細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生了更多的細(xì)胞克隆，HepG2-shIRX3細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞克隆少于對(duì)照細(xì)胞；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)IRX3顯著增強(qiáng)了SMMC7721的遷移和侵襲能力，而下調(diào) IRX3顯著降低了 HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力；miR-377在HepG2和S

8、MMC7721細(xì)胞中低表達(dá)；與轉(zhuǎn)染Control mimics相比，轉(zhuǎn)染了miR-377 mimics的HepG2和SMMC7721細(xì)胞中IRX3的蛋白表達(dá)水平明顯降低，mRNA水平無明顯差異；報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-377顯著降低了IRX3-3’UTR-WT的熒光素酶活性，而IRX3-3’UTR-MUT不受miR-377影響；miR-377過表達(dá)消除了過表達(dá)IRX3對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：