群感效應(yīng)抑制劑的篩選及QSI對銅綠假單胞菌作用的研究.pdf

1、抗生素在抗細菌感染的過程中發(fā)揮著里程碑式的作用。但抗生素的濫用和亂用嚴重引起細菌耐藥問題。因此需要尋找新途徑和新靶點，群感效應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitor QSI）是通過阻斷信號分子傳遞信息，調(diào)控靶基因從而影響毒力因子等次級代謝物。銅綠假單胞菌(Psendomonas）感染性強，嚴重威脅著人類健康，其群感效應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing QS）調(diào)控毒力因子和生物膜的形成。本文通過具有革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)

2、的報告菌株，從部分清熱解毒類中藥中篩選出具有群感效應(yīng)抑制作用的成分，并研究對銅綠假單胞菌QS的作用及機理。
　　將備選藥物經(jīng)QS報告菌株紫色桿菌CV026和根癌農(nóng)桿菌A136篩選，運用報告平板法對比抑菌圈與抑色素圈進行初篩。通過MIC法檢測各藥物對兩種報告菌株的最低抑菌濃度，選擇藥物MIC下濃度梯度進行報告平板法復(fù)篩，初步確定車前草具有抑制群感效應(yīng)的作用，有效濃度范圍為MIC~1/4MIC（63ug/mL~16ug/mL）。

3、>　　由于車前草粗體物中含有大量鞣酸和酯類等物質(zhì)。經(jīng)過分離提取與硅膠柱純化，將各組分經(jīng)CV026的報告平板法篩選，確定車前草乙酸乙酯部位的PE12為潛在的QSI成分。
　　首先通過MIC實驗確定PE12對銅綠假單胞菌PA01的最低抑菌濃度，并選擇MIC、1/2MIC、1/4MIC濃度（16ug/mL，8ug/mL，4ug/mL）作為實驗組。用MTT法檢測藥物組和對照組對PA01生長曲線的影響，再作用于QS相關(guān)毒力因子綠膿菌素、藻酸

4、鹽、鼠李糖、蛋白水解酶和氧化應(yīng)激能力。結(jié)果顯示MTT實驗中16ug/mL顯著抑制PA01生長和毒力因子，8ug/mL，4ug/mL無抑菌作用。綠膿菌素第1，5，7天的產(chǎn)量8ug/mL藥物組較對照組分別抑制了8.33％，3.10%，11.01%，7.14%，P<0.05,作用與16ug/mL藥物組相同，P>0.05；藻酸鹽1，3，5，7天的產(chǎn)量，8ug/mL藥物組較對照組分別抑制了92.15%，89.41%，70.28%，46.73%，P

5、<0.01，與16ug/mL作用相近，P>0.05；鼠李糖含量分別在24h和72h檢測，8ug/mL藥物組較對照組分別抑制了60.96%，43.66%。P<0.01，作用低于16ug/mL藥物組，P<0.05；外毒素A于5.5h和24h檢測，8ug/mL藥物組較對照組抑制了39.58%，60.09%，P<0.01，與16ug/mL藥物組作用接近，P>0.05。但對蛋白水解酶的作用均較微弱，僅第一天作用明顯，P<0.01。在4ug/mL藥

6、物濃度時，抑制作用明顯減弱，僅對鼠李糖，和綠膿菌素有部分作用。
　　考察PE12三個濃度對生物膜形成期7天的作用，通過半定量法、銀染法、掃描電鏡法考察。結(jié)果顯示16ug/mL具有抑制菌量及生物膜的形成，8ug/mL能夠抑制生物膜。生物膜半定量結(jié)果顯示16ug/mL與8ug/mL對生物膜有抑制作用，對比對照組1，3，5，7天分別抑制了37.32%，51.89%，67.60%，35.38%，P＜0.01，其中16ug/mL比8ug/m

7、L藥物組，P＜0.01。4ug/mL只有第3、5天有微小的作用。對照組和8ug/mL藥物組在96h的半定量實驗中可見，8ug/mL藥物濃度下對生物膜形成42h后的抑制作用顯著增強，對照組為（1.95±0.06）而8ug/ml藥物組下降至（1.22±0.1），P＜0.01。顯微鏡和電鏡下可見菌體散在分布，成團少，黏性物質(zhì)較稀薄。1/4MIC（4ug/mL）和對照組，菌體大量聚集，周圍清晰可見黏性物質(zhì)生物膜。
　　選擇MIC和1/2M

8、IC的PE12藥液為實驗組培養(yǎng)菌液后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，通過實時熒光定量PCR監(jiān)測相關(guān)基因lasR、LasI和rhlR的變化。結(jié)果顯示8ug/mL對信號分子合成酶基因lasI有顯著抑制作用，8ug/mL藥物組較對照組抑制了38.02%,P<0.01，對 lasR基因有抑制作用，8ug/mL藥物組較對照組抑制了47.93%,P<0.01，對 rhlR基因有抑制作用，8ug/mL藥物組較對照組抑制了25.76%,P<0.01，8ug/m