假單胞菌喹諾酮信號系統(tǒng)抑制劑的篩選與研究.pdf

1、臨床細菌的耐藥性成為醫(yī)學研究領(lǐng)域的重大課題。隨著科學研究的深入，細菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)并逐漸闡明，其對細菌感染能力具有重要作用。通過抑制細菌群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)可以有效降低細菌的感染能力，并且不會對細菌的生長產(chǎn)生威脅，從而避免細菌產(chǎn)生耐藥性。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種機會致病菌，對肺囊性纖維化等免疫缺陷型病人感染率很高。喹諾酮信號系統(tǒng)(Pseudomonas q

2、uinolone signal system，pqs)是銅綠假單胞菌群體感應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重要組成部分，其相關(guān)信號分子是細菌種間交流的媒介，但目前對該系統(tǒng)研究相對較少。本文構(gòu)建了針對銅綠假單胞菌喹諾酮信號系統(tǒng)的抑制劑篩選模型體系，目的是從中藥粗提物中篩選得到較好的群體感應(yīng)抑制劑，為開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本文構(gòu)建了針對銅綠假單胞菌喹諾酮信號系統(tǒng)的抑制劑篩選菌株P(guān)QSI1，其由野生型銅綠假單胞菌PAOI與質(zhì)粒pPQSI1構(gòu)成。質(zhì)粒

3、pPQSI1由長度344bp的PpqsA啟動子及蔗糖致死基因（sacB）組成?；蚪M表達的調(diào)控蛋白PqsR與信號分子PQS形成的活性復(fù)合物可以啟動sacB基因表達，導致細菌死亡;在群體感應(yīng)抑制劑存在條件下，sacB基因不能表達，細菌無蔗糖致死現(xiàn)象。通過測定細菌密度來表征化合物的群體感應(yīng)抑制活性，菌液密度越高則化合物抑制活性越大。這種液體篩選體系具有經(jīng)濟及操作簡便的特點，可用于高通量篩選群體感應(yīng)抑制物。由于篩選得到的抑制物通常為粗提物，所

4、以本文同時構(gòu)建了可以追蹤抑制劑的菌株P(guān)QSI2。模型質(zhì)粒pPQSI2由長度為493bp的PpqsA啟動子及下游sacB基因組成。利用薄層層析技術(shù)將陽性粗提物中化合物進行分離，將混有PQSI2菌液的固體培養(yǎng)基鋪在薄層板表面培養(yǎng)。通過直接觀察活細菌位置可以判定群體感應(yīng)抑制劑在薄層板上的位點。這種生物自顯影技術(shù)具有直觀性的特點。本實驗將高通量篩選模型PQSI1與生物自顯影模型PQSI2相結(jié)合，形成了一套有效獲得群體感應(yīng)抑制劑的模型體系。

5、>　　本文利用高通量液體篩選模型PQSI1對50多種中藥提取物進行群體感應(yīng)抑制活性檢測，發(fā)現(xiàn)羌活、厚樸及大葉紫珠等10種中藥粗提物的抑制活性較好，其中羌活群體感應(yīng)抑制活性最佳。利用減壓硅膠柱色譜、SephadexLH-20凝膠柱色譜及高效液相色譜技術(shù)，并結(jié)合生物自顯影模型PQSI2對群體感應(yīng)抑制劑進行追蹤分離，得到純度在98％以上的群體感應(yīng)抑制活性化合物。經(jīng)陽離子質(zhì)譜及核磁譜鑒定抑制活性化合物為法卡林二醇。在亞抑菌濃度范圍內(nèi)，法卡林二醇

6、對銅綠假單胞菌毒力因子彈性蛋白酶、綠膿菌素和鼠李糖脂等產(chǎn)量具有較好的抑制活性;在10μM濃度下其對綠膿菌素產(chǎn)量抑制程度可以達到70％。法卡林二醇不僅對銅綠假單胞菌swarming運動具有較好的抑制效果，而且在20μM濃度下其對銅綠假單胞菌生物被膜的降低程度達60％。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明法卡林二醇可以有效抑制銅綠假單胞菌las、rhl和pqs群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的表達水平。
　　本實驗研究首次成功構(gòu)建了用于銅綠假單胞菌