功血雌激素誘導VEGF-MMPs途徑及其血清標志物研究.pdf

1、功能失調(diào)性子宮出血（Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB）簡稱功血，是由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂所致的異常子宮出血，分為無排卵性功血（anovulatory dysfunctional uterine bleeding，ADUB）和排卵性功血（ovulatory dysfunctional uterine bleeding，ODUB）兩類，是婦科常見病，嚴重危害婦女身心健康。有研究表明多數(shù)DUB中雌

2、激素和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2/9）水平增高，且雌激素可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），認為雌激素刺激是DUB的誘因，但是，雌激素引起DUB的分子機制尚不清楚，也不明確MMPs、VEGF在其機制中的具體作用。為研究雌激素是否能直接刺激子宮內(nèi)膜上皮細胞MMP-2/9表達，推測DUB的發(fā)生機制，在海南省自然科學基金（30633\812148）的資助下，研究發(fā)現(xiàn)ADUB的子宮內(nèi)膜MMP-2/9表達增高，雌激素能誘導原代子宮內(nèi)膜上皮細胞MM

3、P-2/9增高表達，通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達后激活ErK信號通路來調(diào)節(jié)MMP-2/9表達水平，VEGF起中心調(diào)節(jié)作用；在此基礎(chǔ)上，分別從動物細胞和整體水平研究雌激素刺激后 MMP-2/9和緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1的表達，檢測子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮單層細胞和子宮內(nèi)膜血管的通透性，確定雌激素刺激后增加MMP-2/9的表達，并且

4、MMP-2/9的增高表達導致子宮內(nèi)膜血管通透性增加，而MMP-2/9抑制劑SB-3CT能降低子宮內(nèi)膜血管通透性，為治療無排卵性功血的新藥研發(fā)提供科學的理論依據(jù)；同時研究應用蛋白質(zhì)組學SELDI技術(shù)篩選鑒定出ADUB和ODUB共同的血清標志物血清淀粉樣蛋白A（SAA)，發(fā)現(xiàn)高濃度SAA降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（ESC）活力，在一定的濃度范圍內(nèi)，SAA劑量和時間依賴性下調(diào)VEGF表達，揭示SAA在DUB的診治和預后中的臨床意義。
　　第一

5、部分、VEGF在雌激素誘導MMP-2/9表達中作用
　　目的：研究雌激素誘導功血的分子機制。已知VEGF與長期無孕酮對抗的雌激素刺激導致的功血發(fā)生相關(guān)聯(lián)，MMPs通過分解膠原增加血管通透性，但雌激素如何誘導VEGF表達以及VEGF如何調(diào)控MMPs的表達尚不清楚。故這一部分的研究擬在ADUB的子宮內(nèi)膜上及原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞上研究VEGF調(diào)控MMPs表達的信號途徑，分析并找出其分子機制。
　　方法：原位Zymograph

6、y技術(shù)檢測ADUB患者子宮內(nèi)膜中MMP2/9的活性和表達水平，原代培養(yǎng)的人子宮上皮細胞，用雌激素刺激細胞，實時RT-PCR和western blot分別檢測mRNA和蛋白表達水平，明膠zymography檢測MMP-2/9的活性，觀測VEGF沉默后細胞P44/42MAPK通路變化，及MMP-2/9表達水平變化，及P44/42MAPK特異阻斷劑U0126阻斷 Erk的磷酸化對MMP-2/9及VEGF表達的影響。
　　結(jié)果：ADUB患

7、者子宮內(nèi)膜中MMP2/9的活性和表達水平都增高，原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)雌激素能誘導MMP-2/9和VEGF表達增高，同時，發(fā)現(xiàn)雌激素能激活P44/42MAPK(Erk1/2)信號通路，RNA干擾技術(shù)沉默VEGF的表達后細胞P44/42MAPK通路被阻斷，且MMP-2/9表達下調(diào)，U0126阻斷Erk的磷酸化能下調(diào)MMP-2/9的表達但不能下調(diào)VEGF的表達。
　　結(jié)論：VEGF首先激活Erk1/2信號通路，然后通過Erk

8、1/2的磷酸化刺激MMP-2/9表達，VEGF在雌激素誘導MMP-2/9的表達中起中心調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分、雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞通透性影響及分子機制
　　目的：研究雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜組織血管通透性和原代培養(yǎng)的大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞通透性的影響，及其通透性改變與MMP2/9表達水平、細胞緊密連接蛋白、VEGF表達水平的關(guān)系。
　　方法：Transwell裝置測定單層血管內(nèi)皮細胞的通透性，qRT-PCR

9、和western-blotting分別檢測 MMP2/9及細胞緊密連接蛋白（Occludin、Claudin-5、ZO-1）的mRNA和蛋白表達水平，明膠酶譜法測定MMP2/9活性，MTT法分析細胞活力，冰凍切片后PI染色測定大鼠子宮內(nèi)膜組織血管通透性，細胞免疫熒光測定單層血管內(nèi)皮細胞的細胞緊密連接蛋白ZO-1的分布，使用MMP2/9的特異抑制劑干預，觀察上述指標的改變情況。
　　結(jié)果：雌激素增加子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞的通透性，并呈

10、劑量和時間依賴性，可被MMP-2/9抑制劑SB-3CT所抑制；隨雌激素誘導MMP-2/9表達水平上升及其活性的增強，內(nèi)皮細胞之間的連接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1表達水平下降，進而使細胞之間的空隙增大，通透性增加，上述作用可被MMP-2/9抑制劑SB-3CT所抑制；動物整體和細胞水平研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)雌激素誘導VEGF表達上調(diào)，SB-3CT雖然可以抑制MMP-2/9的表達水平升高和活性增加，但不能抑制雌激素誘導VEGF

11、表達上調(diào)；本研究發(fā)現(xiàn)阻斷MMP-2/9能高效阻斷雌激素引起的子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞的通透性的增加，為以MMP-2/9治療功血提供了新的藥物高效干預潛在靶點。
　　結(jié)論：雌激素可通過誘導VEGF生成，促進MMP-2/9表達，分解細胞緊密連接蛋白，導致子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞的通透性增加，并可被MMP-2/9的抑制劑所抑制。
　　第三部分、ADUB血清標志物篩選鑒定及其在月經(jīng)血中的表達
　　目的：目前臨床診斷功血主要依據(jù)病史、超

12、聲檢查以及子宮內(nèi)膜活檢，需排除生殖器官疾病或全身性疾病引發(fā)的生殖器官出血?；颊邚陌l(fā)病到確診可能經(jīng)歷較長的時間，延誤病情治療，給患者造成較大的痛苦。所以，如何早期篩查和診斷功血是功血研究的重要課題。本研究采用蛋白質(zhì)組學的新技術(shù)SELDI對ADUB患者和正常婦女血清中的標志蛋白進行篩選。
　　方法：應用SELDI對ADUB患者和正常婦女血清中的標志蛋白進行篩選， 同時，采用Tricine- SDS-PAGE膠分離、質(zhì)譜鑒定和

13、免疫共沉淀對檢測到有差異的蛋白峰進行蛋白質(zhì)鑒定，并采用ELISA、RT-PCR和Western-blotting進一步驗證被鑒定的蛋白質(zhì)在功血患者和正常婦女月經(jīng)中的表達。
　　結(jié)果：采用蛋白質(zhì)組學新技術(shù)-SELD篩選ADUB的血清蛋白質(zhì)標志物，得到兩個差異蛋白峰，進一步采用Tricine-SDS-PAGE膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀將它們鑒定為SAA和VEGF，通過ELISA、RT-PCR、Western-blotting檢測，確

14、證SAA在ADUB患者的月中表達上調(diào)，而VEGF在正常婦女的月經(jīng)中表達上調(diào)，與SELDI技術(shù)篩選的結(jié)果以及蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果一致。
　　結(jié)論：SAA和VEGF是ADUB功血患者的重要血清標志物。
　　第四部分、ADUB和ODUB血清蛋白標志物的比較研究
　　目的：從蛋白質(zhì)水平探索疾病的致病機理，更能直接地闡明生命在生理或病理條件下的變化機制，對ADUB和ODUB病人的血清標志物進行比較有可能找到其共同的血清標志物。

15、　　方法：應用SELDI技術(shù)對ADUB和ODUB患者及正常婦女血清中的標志蛋白進行篩選，同時，采用Tricine- SDS-PAGE膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀對檢測到有差異的蛋白峰進行蛋白質(zhì)鑒定，并采用ELISA、RT-PCR和Western-blotting進一步驗證被鑒定的蛋白質(zhì)在功血患者和正常婦女月經(jīng)中的表達。
　　結(jié)果：應用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選功能失調(diào)性子宮出血的血清蛋白質(zhì)標志物，得到3個差異蛋白峰，進一步鑒

16、定為SAA、VEGF和VKOR，通過ELISA、RT-PCR、Western-blotting檢測，證實SAA在ADUB和ODUB患者的月經(jīng)中表達上調(diào)，VEGF在ADUB患者的月經(jīng)中表達下調(diào)，而VKOR在ODUB患者的月經(jīng)中表達下調(diào)。
　　結(jié)論：SAA是ADUB和ODUB兩類功血共同的血清標志物。
　　第五部分、SAA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞VEGF表達的影響
　　目的：探索功血血清標志物SAA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞VEGF表達

17、的影響，初步分析SAA在功血中的病理生理學意義。
　　方法：MTT法分析細胞活力，并采用qRT-PCR、Western-blotting和ELISA分別檢測VEGF的mRNA、蛋白表達水平和分泌水平，細胞免疫組織化學測定vimenatin鑒定ESC細胞純度。
　　結(jié)果：加SAA處理后，細胞連接松散，細胞貼壁能力差，部分細胞呈現(xiàn)皺縮，脫落的細胞增多。但低濃度SAA對ESC的存活并無影響，當SAA濃度達到60mg/L，ESC細胞

18、的存活率顯著下降（P＜0.05，與對照組比較），且隨SAA濃度的升高，ESC細胞存活率進一步下降，當SAA濃度達到200mg/L，對ESC細胞的存活率影響最大，SAA濃度達到400mg/L時與200mg/L無顯著性差異。低濃度（10mg/L）能升高VEGF的mRNA和蛋白及分泌水平，但隨著SAA濃度的升高，與對照組比較，VEGF的mRNA水平、蛋白水平、分泌水平均顯著下降，以40mg/L的效果最顯著。由以上結(jié)果可見，SAA在一定濃度范圍

19、內(nèi)可濃度依賴性地下調(diào)VEGF基因的表達及分泌，低濃度SAA反而有上調(diào)VEGF基因表達的作用，這一點值得注意。由于20mg/L的SAA顯著下調(diào)VEGF的表達，故取該濃度研究SAA調(diào)控VEGF表達的時間效用，可見在短時間內(nèi)VEGF表達水平顯著上升，但隨著時間的延長，其表達水平逐漸下降，36h和72h的表達水平顯著低于對照組。
　　結(jié)論：高濃度SAA使 ESC細胞的活力下降，在一定的濃度范圍內(nèi)，SAA劑量和時間依賴地下調(diào)VEGF的表達。