4-壬基酚暴露所致雄性生殖毒性及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分4-壬基酚對(duì)雄性大鼠的生殖毒性及凋亡機(jī)制研究
　　目的：4-壬基酚(4-nonylphenol, NP)為一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有擬機(jī)體雌激素樣活性，NP所誘導(dǎo)的雄性生殖毒性效應(yīng)及其毒作用分子機(jī)制，是生殖毒理學(xué)領(lǐng)域界的研究熱點(diǎn)之一。睪丸組織細(xì)胞增殖-凋亡的動(dòng)態(tài)平衡維持著睪丸正常結(jié)構(gòu)、功能及其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。本課題旨在研究NP暴露對(duì)成年大鼠附睪精子參數(shù)和睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)，以成年期和青春期SD大鼠為受試對(duì)象，以睪

2、丸組織細(xì)胞的增殖-凋亡情況為研究主線索，從線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑的角度，來(lái)探索NP致雄性生殖毒性的潛在發(fā)生機(jī)制。
　　方法:將24只50日齡處于成年期的雄性SD大鼠，隨機(jī)分成四組(每組6只):0、25、50和100 mg/kg NP組,每?jī)商旄骨蛔⑸湟淮?，連續(xù)染毒20天；將24只35日齡處于青春期的雄性SD大鼠，隨機(jī)分成四組(每組6只):0、5、20和60 mg/kg NP組,每?jī)商旄骨蛔⑸湟淮危B續(xù)30天；采用計(jì)算機(jī)輔

3、助精液分析系統(tǒng)(CASA)分析大鼠附睪中精子各類(lèi)參數(shù)；ELES A法測(cè)定血清FSH、LH、T水平和睪丸組織果糖含量；比色法檢測(cè)血清、睪丸組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量；HE染色觀察大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；熒光TUN E L法檢測(cè)大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡；免疫熒光法檢測(cè)大鼠睪丸組織Ki-67增殖指數(shù)；DHE熒光探針染色法觀察大鼠睪丸組織ROS水平；利用酶標(biāo)儀定量測(cè)定大鼠睪丸組織超氧陰離子自由基(O2??)和過(guò)氧化氫(H2 O2)

4、含量；透射電鏡法觀察睪丸組織內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)睪丸組織目的基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:100 mg/kg NP組與對(duì)照組比較，50日齡大鼠附睪精子VCL、VAP和A&B級(jí)精子數(shù)量組間差異顯著；與對(duì)照組比較，100 mg/kg NP組附睪精子畸形率明顯增加，且該組睪丸組織精曲小管退化明顯；100 mg/kg NP組血清FSH和LH顯著降低；50 mg/kg NP組和100 mg/k

5、g NP組的血清T、睪丸組織果糖含量均顯著降低；50 mg/kg NP組和100 mg/kg NP組睪丸組織ROS含量、O2??和H2O2含量均顯著增加；50 mg/kg NP組和100 mg/kg NP組血清和睪丸組織SOD及GSH-Px活性均顯著降低、MDA含量明顯增加；100 mg/kg NP組睪丸組織抗氧化基因SOD1、CAT、GPx和CYP1B1的mRNA表達(dá)顯著降低；100 mg/kg NP組睪丸組織精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、

6、次級(jí)精母細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cells, SCs)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells）的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有明顯改變，100
　　mg/kg NP組睪丸組織的細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，50日齡50 mg/kg NP組和100 mg/kg NP組睪丸組織Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)；Bax、Fas、FasL和p53蛋白表達(dá)均上調(diào)；35日齡20 mg/kg NP

7、組和60 mg/kg NP組睪丸組織Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯降低；Apaf-1、Cytochrome c、Cleaved-caspase-3、Ba x、Fas、Fas L和p53蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。
　　結(jié)論:NP暴露可誘導(dǎo)SD大鼠機(jī)體和睪丸組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起睪丸組織細(xì)胞增殖-凋亡失衡，干擾機(jī)體生殖激素合成和睪丸組織能量代謝，這些都可能是NP誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞異常和精子質(zhì)量降低的作用機(jī)制。同時(shí)NP暴露后所激活的線粒體通路和死

8、亡受體通路，很可能參與NP致睪丸組織細(xì)胞凋亡的過(guò)程。
　　第二部分4-壬基酚致睪丸支持細(xì)胞凋亡、自噬和壞死及其分子機(jī)制研究
　　目的:Akt、AMPK、JNK和mTOR信號(hào)在生物機(jī)體內(nèi)，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和自噬等生理及病理過(guò)程。睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell, SC)是生精小管內(nèi)，唯一直接與生精細(xì)胞接觸的體細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)生精細(xì)胞的增殖和成熟有重要的作用，同時(shí)，SC為精子發(fā)生提供適宜的

9、微環(huán)境。本課題旨在研究NP暴露對(duì)原代大鼠SCs的影響；以Akt、AMPK、JNK和mTO R信號(hào)為切入點(diǎn)，對(duì)NP毒作用機(jī)制開(kāi)展相關(guān)的探索性研究。
　　方法:采用不同終濃度的NP(5-60μM)染毒離體培養(yǎng)的SCs后，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)SCs細(xì)胞活力；JC-1熒光探針檢測(cè)SCs細(xì)胞線粒體膜電位的改變；透射電鏡觀察SCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SCs細(xì)胞凋亡分布、周期變化和細(xì)胞內(nèi)ROS含量；MDC熒光染色標(biāo)記SCs細(xì)胞內(nèi)自

10、噬囊泡；DCFH-DA熒光探針測(cè)定SCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平；細(xì)胞免疫熒光法觀察SCs細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)情況；ROS抑制劑NAC、自噬抑制劑3-MA分別對(duì)SCs的預(yù)處理，接著SCs暴露于NP，進(jìn)而觀察細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的發(fā)生情況；RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)SCs目的基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組比較，≥20μM NP染毒SCs24 h后，其細(xì)胞活力顯著降低；20μM和30μM NP誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期周期阻

11、滯、細(xì)胞線粒體膜電位降低、細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積；導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死；促發(fā)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬；與此同時(shí)，SCs抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的蛋白表達(dá)均降低，促凋亡蛋白Bax、Bad和Bim的蛋白表達(dá)表達(dá)均增加，Cytochrome c、Apaf-1和Cleaved-caspase-3蛋白均高表達(dá)，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21、P27、Cyclin D1、Cyclin A和Cyclin B1表達(dá)改變異常，MDC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著的增加，自噬標(biāo)志性

12、蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)、LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)比值均顯著增加；此外，20μM和30μM NP分別染毒SCs6 h、12 h和24 h后，Thr172p-AMPK/AMPK和 Thr183/185p-JNK/JNK蛋白表達(dá)均上調(diào)，Bax、Cleaved-caspase-3、Cytochrome c和Beclin-1蛋白表達(dá)及LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)比值均上調(diào)，Ser473p-Akt/Akt、T hr1462p-TS

13、C2/TSC2、Ser2448p-mTOR/mTO R、Thr389p-p70S6K/p70S6K和Thr37/45p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)比值均顯著降低；ROS抑制劑NAC預(yù)處理SCs后，可有效的抑制NP致細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量產(chǎn)生，與此同時(shí)，NP致SCs發(fā)生細(xì)胞自噬、凋亡和壞死的能力被有效地抑制，NP所誘導(dǎo)的AMPK、Akt、JNK和mTOR/p70S6K/4EBP1信號(hào)的異常改變亦被有效地逆轉(zhuǎn)。自噬抑制劑3-MA對(duì)SCs的預(yù)處

14、理，可抑制NP促細(xì)胞自噬的能力，與此同時(shí)，NP促細(xì)胞凋亡和壞死的能力進(jìn)一步增強(qiáng)，此外，NP所誘導(dǎo)的AMPK、JNK和mTOR/p70S6K/4EBP1信號(hào)異常改變亦被逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:NP對(duì)SCs具有細(xì)胞毒性；NP誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)量ROS很可能是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡和壞死的上游信號(hào)分子；NP暴露促發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)生這一過(guò)程很可能是SCs在接受外界環(huán)境的刺激或處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的一種自我保護(hù)機(jī)制；ROS-Akt信號(hào)很可能參與NP致SC

15、s發(fā)生細(xì)胞凋亡的過(guò)程；ROS-JNK信號(hào)和ROS-AMPK-mTOR信號(hào)通路很可能參與NP致SCs發(fā)生細(xì)胞自噬的過(guò)程。
　　第三部分4-壬基酚誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞發(fā)生自噬及其AM PK-mTOR信號(hào)調(diào)控機(jī)制
　　目的：本課題擬通過(guò)體內(nèi)研究，觀察NP染毒SD成年大鼠后，其睪丸組織SCs是否發(fā)生細(xì)胞自噬。同時(shí)，結(jié)合體內(nèi)和體外研究，以AMPK-mTOR信號(hào)通路為研究主線，研究AMPK-mTOR信號(hào)是否參與調(diào)控SCs細(xì)胞自噬發(fā)生的過(guò)程，

16、并驗(yàn)證NP所激活的AMPK信號(hào)介導(dǎo)mTOR/p70S6K/4EBP1信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
　　方法:將24只處于成年期(50日齡)雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組(每組6只):對(duì)照組及25、50和100 mg/kg三個(gè)NP染毒組；體外培養(yǎng)原代SCs，根據(jù)是否暴露于NP分為對(duì)照組和NP染毒組(10、20和30μM)；采用AMPK特異性抑制劑Compound C、AMPK特異性激動(dòng)劑AICAR和AMPK siRNA分別與NP聯(lián)用干預(yù)處理SCs；CC

17、K-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；透射電鏡觀察睪丸組織SCs自噬發(fā)生的情況；細(xì)胞免疫熒光法觀察細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)目的基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:50 mg/kg和100 mg/kg NP染毒大鼠后，可促發(fā)其睪丸組織SCs自噬的發(fā)生；與對(duì)照組比較，50 mg/kg和100 mg/kg NP染毒組睪丸組織Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg7和Atg12 mRNA表達(dá)均顯著增加，同時(shí)

18、，睪丸組織Beclin-1蛋白表達(dá)和LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)比值亦顯著增加；25、50、100 mg/kg NP染毒組與對(duì)照組比較，睪丸組織LKB1、AMPK、TSC2、TSC1、Rheb、mTOR、4EBP1、S6K和 p70S6K mRNA表達(dá)組間差異顯著；與對(duì)照組比較，50、100 mg/kg NP染毒組睪丸組織 Thr172p-AMPKα/AMPKα蛋白表達(dá)比值均上調(diào)，同時(shí)，Thr1462p-TSC2/TSC2、Ser2

19、448p-mTOR/mTO R、Thr389p-p70S6K/p70S6K和 Thr37/45p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)比值均下調(diào)；體內(nèi)研究結(jié)果基本與體外研究結(jié)果一致。Compound C和AMPK siRNA分別與NP聯(lián)合處理SCs，可有效地抑制NP促細(xì)胞自噬的能力，與此同時(shí)，也有效地逆轉(zhuǎn)了NP所誘導(dǎo)的TSC2/mTOR/p70S6K/4EBP1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的異常表達(dá)。AICAR與NP聯(lián)合處理SCs，可加劇NP誘導(dǎo)細(xì)胞自噬