吸煙所致雄性大鼠生殖毒性機(jī)制及表觀遺傳機(jī)理研究.pdf

1、目的：通過對香煙暴露生物標(biāo)志物的測定，探討香煙在體內(nèi)的內(nèi)暴露水平；從分子生物學(xué)層面驗證吸煙對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的毒性作用；探討表觀遺傳調(diào)控在吸煙所致雄性生殖毒性中的機(jī)制。
　　方法： SD大鼠240只(雄性160只，雌性80只)，隨機(jī)分為2、4、6、8、12周的低、中、高染毒劑量組及空白對照組。香煙暴露組按不同染毒劑量進(jìn)行呼吸道靜式染毒，每日一次；空白對照組未進(jìn)行香煙暴露處理。于不同時間點(diǎn)分別處死吸煙組和對照組大鼠，進(jìn)行指標(biāo)測定。香

2、煙暴露組雄鼠于處死前1周分別與雌鼠(未染毒)按1∶1合籠交配，懷孕雌鼠自然分娩后連續(xù)觀察仔鼠生長發(fā)育情況21天后實(shí)驗結(jié)束。GC-MS/MS定量分析血漿中尼古丁、可替寧含量；HE染色觀察睪丸組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)； TUNEL法測定睪丸細(xì)胞凋亡情況；免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠睪丸 Caspase-3活性； RT-PCR及 Western Blot法測定線粒體凋亡通路中相關(guān)基因： Apaf-1、caspase-9、Bim、Bcl-w、Bak、及Ub

3、e2B的mRNA和蛋白的表達(dá)；計算各組大鼠的子代出生數(shù)及仔鼠的存活率和死亡率；測定大鼠睪丸組織中組蛋白乙?；讣敖M蛋白去乙?；傅幕钚?；運(yùn)用miRNA高通量芯片測序技術(shù)篩選香煙煙霧暴露后雄性大鼠睪丸組織 miRNAs表達(dá)譜的改變情況，并對其靶基因進(jìn)行預(yù)測。
　　結(jié)果：⑴香煙暴露組大鼠出現(xiàn)張口喘息、流涎，腹式呼吸加劇，鼻噪音等癥狀；且染毒劑量越高，染毒周期越長，體重減少越明顯(P＜0.05)；⑵不同暴露時間及暴露劑量間尼古丁含量的變

4、化無統(tǒng)計學(xué)差異，且暴露時間與暴露劑量間無交互效應(yīng)(P＞0.05)；⑶隨暴露時間的延長，暴露劑量的增加，大鼠血漿中可替寧含量較空白對照組(340±41.97 ng/ml)有所增加，不同暴露周期間可替寧含量的差異存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且暴露時間與暴露劑量存在交互效應(yīng)(P＜0.05)；⑷香煙暴露組大鼠隨染毒時間及劑量的增加，睪丸組織病理學(xué)改變也愈加明顯。12周起大鼠睪丸組織出現(xiàn)明顯的萎縮，大量細(xì)胞裂解，甚至在高劑量組中可見各級生精細(xì)

5、胞完全消失，曲細(xì)精管空虛成網(wǎng)格狀分布。⑸隨暴露周期的延長，染毒組大鼠睪丸組織中逐漸出現(xiàn) TUNEL陽性染色，且12周組染色最為強(qiáng)烈；⑹香煙暴露組大鼠睪丸組織胞漿中含有caspase-3陽性細(xì)胞，陽性蛋白濃度于染毒第2周起逐漸增加(P＜0.05)，染毒第6周起 Caspase-3的蛋白表達(dá)總量顯著升高(P＜0.01)；⑺香煙暴露組大鼠睪丸 Apaf-1基因的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，且不同暴露周期間 Apaf-1基因的mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)

6、計學(xué)意義(P＜0.01)；與空白對照組相比，12周中、高劑量染毒組 Apaf-1基因 mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)有顯著性差異(P＜0.05)；⑻香煙暴露組大鼠睪丸 Capase-9基因的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，且不同暴露周期間 Capase-9基因 mRNA和蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與空白對照組相比，12周中、高劑量染毒組Capase-9基因 mRNA表達(dá)的上調(diào)有顯著性差異(P＜0.05)，8周高劑量及12周中、高劑量

7、染毒組睪丸 Capase-9蛋白表達(dá)的上調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⑼香煙暴露組大鼠睪丸 Bim基因的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，且不同暴露周期間 Bim基因 mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與空白對照組相比，12周低劑量染毒組 Bim基因 mRNA表達(dá)的上調(diào)有顯著性差異(P＜0.01)；⑽香煙暴露初期，大鼠睪丸 Bak基因的mRNA表達(dá)下調(diào)，第8周起表達(dá)逐漸上調(diào)，而 Bak的蛋白表達(dá)持續(xù)上調(diào)，且不同暴露周期間 Bak蛋

8、白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與空白對照組相比，12周高劑量組睪丸 Bak蛋白表達(dá)的上調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⑾香煙暴露組大鼠睪丸 Bcl-w基因的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，不同暴露周期間 Bcl-w蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且暴露時間與暴露劑量間存在交互效應(yīng)(P＜0.01)；與空白對照組相比，6周、8周高劑量及12周各劑量組睪丸 Bcl-w蛋白表達(dá)的下調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⑿香煙暴露初期，

9、大鼠睪丸 Ube2B基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，第8周起表達(dá)逐漸下調(diào)，而 Ube2B的蛋白表達(dá)持續(xù)下調(diào)，且不同暴露周期間 Ube2B蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與空白對照組相比，8周組中、高劑量染毒組和12周中、高劑量染毒組睪丸 Ube2B蛋白表達(dá)的下調(diào)呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；⒀雄性大鼠的子代出生數(shù)隨香煙暴露時間及劑量的增加而減少，不同香煙暴露方式的仔鼠存活率有顯著性差異(P＜0.05)；⒁香煙暴露組大鼠睪丸組蛋白乙?；?HAT)

10、的活性升高，且不同暴露劑量間組蛋白乙?；富钚缘牟町愑薪y(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與空白對照組相比，8周高劑量、12周各劑量染毒組大鼠睪丸組蛋白乙?；富钚缘脑龈哂酗@著性差異(P＜0.05)；⒂香煙暴露組大鼠睪丸組蛋白去乙?；?HDAC)的活性降低，與空白對照組相比，6周高劑量以后各染毒組大鼠睪丸 HDAC活性的下降有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⒃吸煙大鼠睪丸組織 miRNA芯片篩選出5個差異性表達(dá)的miRNAs，其預(yù)測的靶基因主要參