十三種化合物誘導(dǎo)的小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的聚類(lèi)分析.pdf

1、基因芯片技術(shù)與基因組學(xué)研究成果應(yīng)用到毒理學(xué)領(lǐng)域中，推動(dòng)了毒理基因組學(xué)的誕生。毒理基因組學(xué)是生物信息學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合的一個(gè)新分支學(xué)科，是研究基因組與外來(lái)化合物對(duì)機(jī)體不利影響之間關(guān)系的學(xué)科。毒理基因組學(xué)首先將幫助我們了解基因的多態(tài)性對(duì)化合物毒性是否產(chǎn)生影響；其次將使我們可以在基因表達(dá)層次上了解化合物染毒與基因表達(dá)改變之間的關(guān)系，以便更好地了解化合物的毒作用機(jī)理；最后使在基因組水平上對(duì)毒物進(jìn)行分類(lèi)成為可能。本課題設(shè)想利用基因芯片技術(shù)來(lái)研究3

2、類(lèi)共計(jì)13種化合物所誘導(dǎo)的小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜，通過(guò)對(duì)基因表達(dá)譜的聚類(lèi)分析，找出不同化合物的特異“基因指紋”，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)化合物在基因組反應(yīng)水平上進(jìn)行分類(lèi)的嘗試，使化合物的分類(lèi)與其誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜聯(lián)系起來(lái)。同時(shí)對(duì)所研制的毒理學(xué)基因芯片用于化合物毒性分類(lèi)進(jìn)行探索。主要的結(jié)果如下： 一、小鼠毒理基因芯片檢測(cè)平臺(tái)的建立與香港城市大學(xué)合作，共同研制開(kāi)發(fā)了小鼠毒理基因芯片。1.選擇了1796個(gè)基因作為芯片組成，主要涉及細(xì)胞生長(zhǎng)與

3、維持、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、細(xì)胞外基質(zhì)等八個(gè)方面。 2.從NIA小鼠15K和7.4KcDNA文庫(kù)中拷貝出毒理芯片所挑選的基因克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的合格率為97.57％，說(shuō)明小鼠毒理芯片的基因文庫(kù)復(fù)制、擴(kuò)增是成功的。 3.采用PicoGreen熒光染色檢驗(yàn)芯片點(diǎn)樣情況，結(jié)果顯示芯片的熒光染色均勻，信號(hào)強(qiáng)度較高，表明靶標(biāo)的點(diǎn)樣和附著情況良好，芯片質(zhì)量合格，可以用于下一步的芯片雜交實(shí)驗(yàn)。

4、4.陽(yáng)性對(duì)照基因的變異系數(shù)均在0.15以下，表明芯片結(jié)果的變化幅度較小，結(jié)果是可靠的。 5.同批次芯片雜交檢驗(yàn)和不同批次芯片雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同批次和不同批次的兩張芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.908和0.887；差異表達(dá)基因的一致率為100％。表明同一批次和不同批次的芯片間的重復(fù)性很好。 6.自身比較實(shí)驗(yàn)得到的假陽(yáng)性率為0.56％(判斷標(biāo)準(zhǔn)是2.0和0.5)，與國(guó)際報(bào)道的下限相近(0.5％～3％)，證明

5、該系統(tǒng)是穩(wěn)定可靠的，結(jié)果具有重復(fù)性。 二、細(xì)胞模型的建立1.用兩步灌流法分離小鼠肝細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)量一般在107以上，活力在85％～95％之間。細(xì)胞接種后生長(zhǎng)良好。 2.用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)13種化合物的細(xì)胞毒性，繪制其劑量反應(yīng)曲線，并計(jì)算出各化合物的LC30，作為本次毒理基因表達(dá)譜研究的毒性劑量。 三、十三種化合物毒理基因表達(dá)譜分析1.用自配的RNA提取液提取樣品總RNA，獲得的總RNA有較高的純度，可以直接用于基因芯

6、片的雜交。 2.13種化合物在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上共引起580個(gè)基因的表達(dá)明顯差異(ratio≥2.0或ratio≤0.5)，其中在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都有表達(dá)差異的基因有289個(gè)，在4H和24H都有表達(dá)差異的基因有316個(gè)，在4H和72H都有表達(dá)差異的基因有313個(gè)，在24H和72H都有表達(dá)差異的基因有386個(gè)。 3.13種化合物差異表達(dá)基因的數(shù)量從4H、24H至72H隨時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯的時(shí)效反應(yīng)關(guān)系(y=35.462x+34.179，

7、R2=0.9917)，提示在72H時(shí)的基因表達(dá)譜可能提供最完整的差異表達(dá)基因信息。4.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)隨機(jī)挑選的4個(gè)基因在三對(duì)樣品中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明芯片實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是可靠的。 5.用平均連鎖凝聚性分層聚類(lèi)法對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，有以下初步發(fā)現(xiàn)：a)4H的基因表達(dá)譜分類(lèi)結(jié)果與化學(xué)結(jié)構(gòu)的分類(lèi)有很大不同，結(jié)合差異表達(dá)基因的數(shù)量在時(shí)間上的分布情況等考慮，推測(cè)可能是由于

8、4H時(shí)的基因表達(dá)譜主要以應(yīng)激反應(yīng)為主，尚不能完全代表化合物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。 b)24H和72H的基因表達(dá)譜分類(lèi)結(jié)果較接近，而4H的分類(lèi)結(jié)果與前兩者相比差別較大，提示基因表達(dá)譜在24H至72H這一段時(shí)間內(nèi)可能是穩(wěn)定的。 c)DMBA與DBA的基因表達(dá)譜分類(lèi)結(jié)果在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都是相同的，而且聯(lián)系最為緊密，提示它們產(chǎn)生毒性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可能是四元環(huán)，與側(cè)鏈基團(tuán)關(guān)系不大。 d)24H和72H的基因表達(dá)譜分類(lèi)結(jié)果與按化學(xué)結(jié)構(gòu)