扶正清熱利濕方治療泛耐藥大腸埃希氏菌尿路感染小鼠模型實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、尿路感染(urinarytractinfection，UTI，簡(jiǎn)稱(chēng)尿感)是指病原體在機(jī)體內(nèi)尿路中生長(zhǎng)繁殖，侵犯尿路粘膜或組織而引起的尿路炎癥，是臨床上最常見(jiàn)的感染性疾病之一。它主要由細(xì)菌感染引起，其中以大腸桿菌最為常見(jiàn)。導(dǎo)致尿路感染的大腸桿菌又稱(chēng)為致病性大腸桿菌或致腎盂腎炎大腸桿菌(uropathogenicEscherichiacoli，UPEC)。在本研究的前期階段，我們針對(duì)UPEC尿路感染的發(fā)病機(jī)制及治療方法進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)

2、細(xì)菌耐藥是臨床治療UPEC尿路感染的關(guān)鍵和難點(diǎn)。為了達(dá)到預(yù)想的結(jié)果，進(jìn)一步尋找安全有效的抗生素替代治療方案有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，而這也正是發(fā)揮中醫(yī)辨證論治優(yōu)勢(shì)所在。因此，尋找新的具有治療價(jià)值的復(fù)方扶正清熱利濕方已成為尿路感染研究的重要內(nèi)容。扶正清熱利濕方，是包含了十多種扶正清熱利濕方成分的一種復(fù)方藥，從中醫(yī)辨證論治角度來(lái)講，它可以達(dá)到清熱利濕通淋，滋陰補(bǔ)腎健脾，以扶正祛邪的治療效果。
　　 因此，本論文以前期研究結(jié)果所篩選出的

3、致病性強(qiáng)、耐藥性廣、生物膜陽(yáng)性且產(chǎn)ESBL的UPEC菌株為研究對(duì)象，采用尿道插管法來(lái)建立UPEC尿路感染的小鼠模型，以扶正清熱利濕方和抗生素（亞胺培南）對(duì)小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，并通過(guò)監(jiān)測(cè)治療前后小鼠的癥狀、體征以及各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，評(píng)估扶正清熱利濕方對(duì)UPEC菌尿路感染的治療效果。最后得出結(jié)論:扶正清熱利濕方對(duì)高致病、多重耐藥UPEC尿路感染小鼠模型具有治療作用，且與抗生素亞胺培南的療效相當(dāng)。
　　 本課題主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研

4、究:
　　 首先，基于實(shí)驗(yàn)室前期在扶正清熱利濕方抗菌上的研究結(jié)果，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已報(bào)道的大腸桿菌毒力因子以及耐藥基因的分布及作用分析結(jié)果，共挑選了95株臨床分離UPEC菌株對(duì)UPEC中廣泛分布的24對(duì)毒力基因進(jìn)行篩選，最終得到了致病性都很強(qiáng)的15株UPEC菌，并對(duì)致病性都很強(qiáng)的15株大腸桿菌進(jìn)行了有關(guān)毒力表型的相關(guān)檢測(cè)及耐藥譜的分析;最終得出的結(jié)論:UPEC5、UPEC10、UPEC169菌，均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象、其中UPEC10和U

5、PEC169菌屬生物膜陽(yáng)性菌株，且常見(jiàn)抗生素的耐藥率高，同時(shí)，UPEC10菌株還是ESBL陽(yáng)性菌株，且耐藥性更廣。進(jìn)而結(jié)合95株臨床分離UPEC菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥性分析其中毒力基因、耐藥基因的分布及其與耐藥性的內(nèi)在關(guān)系;最終我們得出結(jié)論:毒力、耐藥基因數(shù)與抗生素的耐藥程度有顯著的相關(guān)性，而且攜帶毒力基因越多的分離株，耐藥性越強(qiáng);耐藥基因分布率高的產(chǎn)ESBL的UPEC菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥性普遍很高。
　　 其次，在構(gòu)建GFP

6、綠色熒光標(biāo)記菌株過(guò)程中，關(guān)鍵是篩選出用于建立尿路感染模型的UPEC菌株。根據(jù)前期研究分析的結(jié)果，選用致病性強(qiáng)、耐藥性廣、生物膜陽(yáng)性且產(chǎn)ESBL的UPEC10作為本實(shí)驗(yàn)研究的試驗(yàn)菌株;采用電轉(zhuǎn)法將GFP熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)菌株UPEC10中，進(jìn)行抗性篩選，并在熒光顯微鏡下篩選熒光細(xì)菌，最終得出結(jié)論:熒光質(zhì)粒已被轉(zhuǎn)入到UPEC10中，熒光標(biāo)記菌株UPEC10-GFP構(gòu)建成功。這為后期順利確定尿路感染模型構(gòu)建是否成功以及把握尿路感染過(guò)程中小鼠體內(nèi)

7、的動(dòng)態(tài)變化差異，奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)抗菌機(jī)制的初步研究，采用微量稀釋的方法對(duì)MIC/MBC以及扶正清熱利濕方的耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)，最終得出的結(jié)論是:扶正清熱利濕方對(duì)UPEC10菌的最小抑菌濃度MIC是125mg/ml，最小殺菌濃度MBC是250mg/ml;扶正清熱利濕方逆轉(zhuǎn)了UPEC10菌的耐藥性;于此同時(shí)，采用MTT法和微量稀釋法來(lái)檢測(cè)生物膜的形成以及扶正清熱利濕方對(duì)生物膜形成的影響，最終得出的結(jié)論是:無(wú)論扶正清熱利濕

8、方在預(yù)先包被或不包被的情況下，扶正清熱利濕方本身對(duì)生物膜的形成都具有一定的抑制作用;而生物膜的存在導(dǎo)致UPEC10菌對(duì)抗生素的抵抗力增強(qiáng)。
　　 最后，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)熒光報(bào)告UPEC10-GFP感染小鼠的濃度和劑量進(jìn)行了摸索和試驗(yàn)，獲得了最佳的菌液感染濃度和最佳劑量，并成功建立了熒光報(bào)告UPEC10-GFP菌感染小鼠模型;然后，采用扶正清熱利濕方和亞胺培南（IPM）對(duì)感染成功的小鼠模型進(jìn)行干預(yù);最后，通過(guò)對(duì)其小鼠脾臟、腎臟、

9、膀胱和尿液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，分析臟器中的細(xì)菌清除率，評(píng)價(jià)扶正清熱利濕方對(duì)多重耐藥UPEC10-GFP菌尿路感染小鼠模型的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，扶正清熱利濕方治療后，各臟器中細(xì)菌計(jì)數(shù)均低于模型組和抗生素組，尿液中的細(xì)菌計(jì)數(shù)與小鼠模型臟器指數(shù)均低于模型組，但與抗生素組相當(dāng)。同時(shí)，經(jīng)灌胃小鼠制備的含藥血清對(duì)細(xì)菌具有一定的抑菌效果。
　　 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，可以進(jìn)一步得出結(jié)論:生物膜的存在使得UPEC耐藥性增加，更加不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，而扶正清

10、熱利濕方可以抑制UPEC生物膜形成，降低UPEC菌在小鼠體內(nèi)的定殖和生存能力，以此，在治療過(guò)程中，扶正清熱利濕方抑制UPEC菌在臟器中寄生的能力可能會(huì)優(yōu)于抗生素。通過(guò)扶正清熱利濕方復(fù)方治療法，細(xì)菌雖然仍部分存在，卻可以抑制細(xì)菌在臟器中寄生，同時(shí)，通過(guò)生物膜改觀(guān)，臟器炎癥損傷也相應(yīng)地減小。
　　 綜上所述，扶正清熱利濕方對(duì)高致病、多重耐藥UPEC尿路感染小鼠模型具有治療作用，且與抗生素亞胺培南的療效相當(dāng)。通過(guò)扶正清熱利濕方治療后，