三硫二丙烯對異煙肼和利福平所致小鼠肝損傷的保護作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的：
　　異煙肼(INH)和利福平(RFP)是兩種主要的一線抗結(jié)核藥物，在結(jié)核病的治療過程中常聯(lián)合使用，能夠有效的治療結(jié)核桿菌感染引起的結(jié)核病。但是，大量的臨床實驗研究及動物實驗研究結(jié)果顯示，異煙肼和利福平在聯(lián)合使用過程中會導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生嚴重的藥物性的肝損傷，甚至是肝衰竭，嚴重威脅著患者的生命健康安全;同時，異煙肼和利福平所引起的藥物性的肝損傷又會致使藥物治療中斷，引起藥物的不規(guī)范使用，導(dǎo)致抗藥性結(jié)核桿菌和耐藥性肝損傷的發(fā)生，

2、嚴重阻礙了結(jié)核病的預(yù)防和控制。異煙肼和利福平所致肝損傷的機制尚未完全明確，目前的研究大部分認為與氧化機制有關(guān)，也有部分研究發(fā)現(xiàn)異煙肼有免疫抑制性，可以引起肝臟組織內(nèi)的免疫系統(tǒng)的紊亂，加劇肝臟組織內(nèi)的損傷。
　　三硫二丙烯(DATS)作為一種大蒜制品，含有豐富的抗氧化活性成分，并且具有廣泛的藥理作用，如提高免疫力，抑制炎癥反應(yīng)等。已有研究表明了三硫二丙烯能夠有效預(yù)防多種藥物如酒精、四氯化碳、砷等引起的肝臟損傷，但是其對異煙肼和利福平

3、聯(lián)合所致肝損傷的保護效果國內(nèi)外尚未見報道。
　　本次研究通過參考國內(nèi)外大量相關(guān)研究的文獻，連續(xù)10天以灌胃的方式給予昆明小白鼠異煙肼和利福平的混合生理鹽水溶液來建立異煙肼和利福平的小鼠肝臟損傷模型，并設(shè)立低、中、高三個劑量的三硫二丙烯進行保護性地干預(yù)研究，通過測量血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等的活性和總膽紅素(T.BILI)的含量指標，以及觀察肝臟組織病理學切片，來研究三硫二丙烯是否具有預(yù)防異煙肼

4、和利福平聯(lián)合所致肝損傷的效果，同時，通過測量肝臟組織內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量水平，肝臟組織內(nèi)的細胞因子白細胞介素(IL-1β)，促炎性因子腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌含量以及免疫組化染色法觀察枯否細胞(KCs)的活化情況和采用小鼠碳顆粒吞噬實驗來檢測小鼠的免疫能力，來探討其可能的氧化抗氧化機制以及免疫機制，為以后的體內(nèi)外的研究及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、動物的處理方法
　　雄

5、性昆明小鼠共120只(SPF，20-22g)，完全隨機的分為六組:空白對照組、INH/RFP處理組、DATS低劑量聯(lián)合處理組、DATS中劑量聯(lián)合處理組、DATS高劑量聯(lián)合處理組、DATS對照組。每組20只，于每日上午9點以灌胃的方式給予DATS低劑量聯(lián)合處理組、DATS中劑量聯(lián)合處理組、DATS高劑量聯(lián)合處理組及DATS對照組相應(yīng)濃度的DATS(10、20、40和40mg/kg bw)，同時給予空白對照組，INH/RFP處理組等體積的玉

6、米油;2小時后，同樣以灌胃的方式給予INH/RFP處理組及DATS低劑量聯(lián)合處理組、DATS中劑量聯(lián)合處理組、DATS高劑量聯(lián)合處理組INH/RFP的混合生理鹽水溶液(100+100mg/kg bw)，同時給予空白對照組和DATS對照組等體積的生理鹽水。持續(xù)的灌胃給藥處理10天后，每組隨機的取10只小鼠進行常規(guī)麻醉后，采用眼球摘除法取血，于4℃1500×g離心20分鐘，收集血清;同時剝離肝臟并稱重，取肝臟的同一部位肝組織固定于中性福爾馬

7、林中，將剩余的肝組織置于液氮中進行快速冷凍后置于-80℃中進行儲存。剩余10只小鼠通過尾靜脈注射印度墨汁(i.v.)進行碳顆粒吞噬實驗以測量小鼠的吞噬能力。
　　2、三硫二丙烯對異煙肼和利福平所致小鼠肝損傷的保護效果評價
　　記錄終末體重值，肝重值并計算肝臟系數(shù);測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GGT)的活性水平以及總膽紅素(T.BILI)的含量指標，以及ALT/GGT

8、活性水平的比值;常規(guī)病理切片蘇木素-伊紅染色（H&E染色），觀察肝臟肝損傷狀態(tài)。
　　3、三硫二丙烯保護異煙肼和利福平所致小鼠肝損傷的氧化抗氧化機制研究
　　測量肝臟組織內(nèi)的還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、總谷胱甘肽(T-GSH)的含量，以及丙二醛(MDA)的含量水平。
　　4、三硫二丙烯保護異煙肼和利福平所致小鼠肝損傷的免疫機制研究
　　采用碳顆粒吞噬實驗方法測量小鼠體內(nèi)吞噬細胞的吞噬能力

9、;肝臟免疫組化切片觀察枯否細胞活化水平;測量肝臟組織內(nèi)的細胞因子IL-1β，促炎性因子TNF-α的分泌水平。
　　5.統(tǒng)計處理方法
　　采用的是SPSS Statistics18.0統(tǒng)計軟件的One-way ANOVA方法進行數(shù)據(jù)分析處理，并進行組間的兩兩比較分析，當P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、血清中的AST、ALT活性以及T.BILI水平的變化情況
　　與空白對照組比較，IN

10、H/RFP處理組小鼠血清中ALT(P＜0.01)、AST(P＜0.05)的活性以及T.bili(P＜0.01)的水平明顯升高:ALT從45.98±6.79上升至123.5±15.89U/L，P＜0.01;AST從100.44±14.89上升到191.85±40.89U/L，P＜0.05;T.Bili從0.38±0.71μmol/L提高到11.36±2.78μmol/L，P＜0.01，GGT(P＜0.01)水平顯著降低，但ALT/GGT比

11、值升高，差異具有統(tǒng)計學意義。DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;與INH/RFP處理組比較，DATS低劑量聯(lián)合處理(PALT、GGT＜0.05)、中劑量聯(lián)合處理(PALT、GGT＜0.01，PT.bili＜0.05)、高劑量聯(lián)合處理（PALT、GGT＜0.01，PAST、T.bili＜0.05）劑量聯(lián)合處理組活性水平有明顯改善，并具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　2、肝臟組織的病理變化情況
　　小鼠肝臟H&E染色結(jié)果顯示，與空白對照組

12、相比，INH/RFP處理組肝臟出現(xiàn)肝損傷，主要表現(xiàn)為肝臟組織內(nèi)的出現(xiàn)大量的大而圓的空泡細胞及細胞壞死，肝組織正常形態(tài)結(jié)構(gòu)消失;DATS對照組未見明顯差異。DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高劑量聯(lián)合處理組出現(xiàn)明顯的改善。
　　3、肝臟內(nèi)GSH和MDA水平變化情況
　　與空白對照組相比，INH/RFP處理組肝臟組織內(nèi)的T-GSH和GSH的含量分別降低了31％(P＜0.05)，55％(P＜0.01)，GSSH的含量升高了1

13、03％(P＜0.01)，DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高劑量聯(lián)合處理組水平有明顯的改善:與INH/RFP處理組比較，T-GSH含量分別升高了17％、20％、45％(P＜0.05)，GSH含量分別升高了61％(P＜0.01)、76％(P＜0.01)、133％（P＜0.01），GSSH含量分別降低了26％(P＜0.05)、38％(P＜0.05)、40％(P＜0.01)。
　　MDA水平是肝臟脂質(zhì)

14、過氧化損傷強度的主要指標。與空白對照組相比，INH/RFP處理組肝臟組織內(nèi)的MDA的含量明顯升高164％(P＜0.01)，DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;與INH/RFP處理組比較，DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高劑量聯(lián)合處理組MDA含量明顯降低47％(P＜0.05)，56％(P＜0.01)，59％(P＜0.01)。
　　4、小鼠碳顆粒吞噬實驗結(jié)果
　　與空白對照組相比，INH/RFP處理組小鼠碳顆粒吞噬能力下降了3

15、9％(P＜0.01)，DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;而DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高劑量聯(lián)合處理組小鼠碳顆粒吞噬能力明顯比INH/RFP處理組升高了62％，67％，79％(P＜0.01)
　　5、肝臟組織內(nèi)的枯否細胞活化水平變化情況
　　肝臟免疫組化切片結(jié)果顯示:與空白對照組相比，INH/RFP處理組枯否細胞活化水平明顯降低，甚至消失，DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高劑量聯(lián)

16、合處理組枯否細胞活化水平明顯恢復(fù)。
　　6、肝臟組織內(nèi)IL-1β，TNF-α水平變化情況
　　與空白對照組相比，IL-1β的水平INH/RFP處理組水平明顯降低39％（P＜0.01），DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;與INH/RFP處理組比較，DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高聯(lián)合處理組的IL-1β分別增加了52％(P＜0.05),82％(P＜0.01),113％(P＜0.01)。
　　與空白對照組相比，TNF-

17、α的水平INH/RFP處理組水平明顯升高了20％(P＜0.01)，DATS對照組未見統(tǒng)計學差異;與INH/RFP處理組比較，DATS低劑量聯(lián)合處理、中劑量聯(lián)合處理、高聯(lián)合處理組的IL-1β分別增加了6％，13％(P＜0.05),16％(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、三硫二丙烯對異煙肼和利福平聯(lián)合所致小鼠肝損傷具有保護作用.
　　2、三硫二丙烯對異煙肼和利福平聯(lián)合所致小鼠肝損傷的保護機制可能與其抗氧化機制有關(guān)。<