小鼠不同免疫抑制劑作用下肺隱球菌感染的炎癥改變和對唑類藥物療效的差異性研究.pdf

1、【目的】
　　利用滴鼻法建立小鼠肺隱球菌感染模型，探討不同免疫抑制劑引起小鼠發(fā)生感染的可行性，為進(jìn)一步研究臨床、分子生物學(xué)、病理改變以及治療的對照研究奠定基礎(chǔ)；比較不同免疫抑制狀態(tài)下小鼠感染隱球菌后的生存期、病死率及疾病終末期時的感染程度的區(qū)別，以及其病理學(xué)差異；探討氟康唑、伏立康唑分別治療不同免疫狀態(tài)的隱球菌感染的療效。
　　【材料與方法】
　　健康雌性BALB/c小鼠，體重20±2g。隨機分為3組，即甲強龍（MP）

2、組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、對照（IC）組，每組20只。MP組為注射甲潑尼龍后接種新生隱球菌懸浮液，CTX組為注射環(huán)磷酰胺后接種新生隱球菌懸浮液，IC組為注射生理鹽水后接種新生隱球菌懸浮液。具體的免疫抑制方法為：MP組于接種前3日每日腹腔注射200mg/kg甲潑尼龍，接種后每日1次維持免疫抑制狀態(tài)；CTX組于接種前3日每日腹腔注射200mg/kg環(huán)磷酰胺，接種后每日1次維持免疫抑制狀態(tài)；IC組相同時間腹腔注射等量的生理鹽水。所有試驗小鼠于

3、接種前3天起每日應(yīng)用抗生素預(yù)防細(xì)菌感染，予頭孢他定150mg/kg腹腔注射，每日1次。接種當(dāng)天每組隨機選取5只小鼠眼眶取血檢測白細(xì)胞計數(shù)。第4日經(jīng)滴鼻法向小鼠鼻內(nèi)接種配置好的新生隱球菌40μl（濃度1.0×108cfu/ml）懸浮液。接種后每日連續(xù)觀察并記錄觀察生存期，在疾病的終末期（CTX組為接種后第7天，MP組及對照組為接種后第18天）處死后取肺、腦組織勻漿行真菌培養(yǎng)，并通過比較菌落數(shù)比較感染程度，同時肺組織行病理檢查（HE、PAS

4、、六胺銀染色）。收集外周血清用于腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的測定。
　　將環(huán)磷酰胺和甲強龍免疫抑制小鼠再分為6組：即環(huán)磷酰胺（CTX）組，環(huán)磷酰胺-氟康唑（CTX-FZ）組，環(huán)磷酰胺-伏立康唑（CTX-VZ）組，甲強龍（MP）組，甲強龍-氟康唑（MP-FZ）組，甲強龍-伏立康唑（MP-VZ）組，每組20只。免疫抑制和滴鼻接種法同上，CTX-FZ組和MP-FZ組于接種后24小時腹腔注射氟康唑注射液（10m

5、g/kg/qd），CTX-VZ組和MP-VZ組接種后24小時予伏立康唑灌胃治療（40mg/kg/qd），CTX組與MP組未予治療。每組隨機挑選10只小鼠用于觀察生存期，剩余的10只CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組在接種后第7天，MP組、MP-VZ組、MP-FZ組于接種后第18天處死后取肺、腦組織勻漿行真菌培養(yǎng)，并通過比較菌落數(shù)比較感染程度，同時肺組織行病理檢查（HE、PAS及六胺銀染色）。
　　【結(jié)果】
　　一、小鼠

6、不同免疫狀態(tài)模型構(gòu)建情況
　?。ㄒ唬┌准?xì)胞數(shù)目改變：
　　CTX組免疫抑制前后白細(xì)胞計數(shù)均值分別為7.65×109/L，5.00×109/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）。MP組免疫抑制前后分別為7.74×109/L，5.38×109/L，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.003）。IC組為分別為7.97×109/L，7.66×109/L，無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.518）。
　?。ǘ┬∈蠓坞[球菌病模型構(gòu)建情況：
　

7、　CTX組接種成功率為100％（11/11），模型建立成功率為100%（11/11）。MP組接種成功率為100%（12/12），模型建立成功率為100%（12/12）。IC組接種成功率為100%（9/9），模型建立成功率為66.67%（6/9）。
　　（三）小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)情況：
　　CTX組中肺組織勻漿真菌培養(yǎng)陽性率100%（11/11），MP組中真菌培養(yǎng)陽性率100%（12/12），IC組真菌培養(yǎng)陽性率100%（9/9

8、）。
　　（四）肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果：
　　CTX組和MP組小鼠鏡下表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)充血及出血性壞死，肺部病變彌漫，真菌負(fù)荷大。對照組小鼠肺部病變局限，真菌負(fù)荷較少。
　　二、不同免疫狀態(tài)感染隱球菌后炎癥改變情況
　?。ㄒ唬┥鏁r間：
　　CTX組、MP組接種后生存時間分別為6.80±1.32d、17.30±2.41d，IC組小鼠未發(fā)生死亡。三組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.020＜0.05）。且M

9、P組小鼠生存期明顯長于環(huán)磷酰胺組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000＜0.05）。
　　（二）小鼠肺組織培養(yǎng)情況：
　　CTX組肺勻漿平板菌落計數(shù)均值為8.6±0.43log10，MP組為8.1±0.58log10，IC組為2.9±0.39log10，三組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012＜0.05），CTX組和MP組菌落數(shù)明顯多于IC組，而MP組與CTX組經(jīng)統(tǒng)計分析無統(tǒng)計學(xué)差異。
　?。ㄈ┬∈箅[球菌病肺外器官受

10、累及培養(yǎng)情況：
　　CTX組中10例（100%）小鼠腦組織真菌培養(yǎng)陽性，MP組中10例（100%）真菌培養(yǎng)陽性，IC組中均未培養(yǎng)出隱球菌，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。CTX組和MP組小鼠腦組織真菌培養(yǎng)菌落計數(shù)經(jīng)統(tǒng)計分析無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（四）小鼠血TNF-α和IL-10相對定量表達(dá)水平的比較：
　?。?）三組研究對象的外周血TNF-α相對定量表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022）。CTX組較IC組和MP組

11、明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.011和0.026）。MP組的TNF-α相對定量表達(dá)水平與IC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（2）三組研究對象的外周血IL-10相對定量表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。CTX組和MP組均高于IC組。
　?。ㄎ澹嶒灲M小鼠病理組織學(xué)對比分析：
　　CTX組表現(xiàn)為肺泡破壞融合，嚴(yán)重程度高于MP組和IC組，三組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。CTX組及MP組小鼠的肺部孢子數(shù)明顯高于IC組，三組差異具有

12、統(tǒng)計學(xué)意義，而CTX組與MP組的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　三、氟康唑、伏立康唑分別治療不同免疫狀態(tài)情況
　?。ㄒ唬┙M間生存時間比較：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組接種后生存時間分別為6.80±1.32d，7.8±0.84d，9.6±2.07d，三組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009）。其中CTX-VZ組小鼠生存期明顯長于CTX組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）。但CTX-FZ組和CTX組無統(tǒng)

13、計學(xué)差異。MP組、MP-FZ組、MP-VZ組接種后生存時間分別為17.3±2.41d，17.5±2.08d，19.5±2.38d，三組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.112）。（二）組間病理組織學(xué)對比：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組的肺泡直徑分別為3.46±0.47mm，3.32±0.41mm，3.16±0.25mm。三組研究對象的肺泡破壞程度比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.491）。MP組、MP-FZ組、MP-

14、VZ組的肺泡直徑為2.72±0.25mm，2.82±0.16mm，2.66±0.11mm。三組研究對象的肺泡破壞程度比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.417）。
　?。ㄈ┓尾空婢?fù)荷比較：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組三組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.039）。且CTX-VZ組小鼠的肺部真菌負(fù)荷較CTX組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013）。MP組、MP-FZ組、MP-VZ組的肺部真菌負(fù)荷比較，