構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程皮膚的研究.pdf

1、研究背景:
　　皮膚是人體面積最大的器官，覆蓋全身，發(fā)揮著保護(hù)、感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌與排泄、吸收、代謝、免疫等作用。作為人體的第一道屏障，皮膚直接與外界接觸，各種物理、化學(xué)、生物等因素都能引起皮膚的損傷，不及時(shí)有效治療會(huì)給患者帶來極大痛苦，甚至威脅生命。對(duì)于皮膚缺損，傳統(tǒng)的治療方法是進(jìn)行皮膚移植或皮瓣移植術(shù)，但存在供體不足和免疫排斥等問題。
　　組織工程皮膚（Tissue Engineering Skin，TES）是將種子細(xì)

2、胞與細(xì)胞外基質(zhì)替代物混合制成的人工皮膚，可用于創(chuàng)面修復(fù)，重建皮膚功能，具有良好的發(fā)展前景。現(xiàn)在已能制備比較成熟的表皮-真皮組織工程皮膚，基本能夠快速覆蓋創(chuàng)面，但是缺乏毛囊等皮膚附屬器。毛囊含有豐富的毛囊干細(xì)胞，在皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)、重建中有重要作用。毛囊所生長(zhǎng)出的毛發(fā)除了調(diào)節(jié)體溫、分泌與排泄等基本功能之外，對(duì)于人類還有影響美觀，進(jìn)而進(jìn)一步影響心理及社交的作用。構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程皮膚不但能促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)，還可以重建皮膚功能，而且對(duì)

3、于脫發(fā)等疾病有一定治療作用。
　　研究目的:
　　1.觀察毛囊胚胎發(fā)育及毛囊干細(xì)胞動(dòng)態(tài)衍變過程，探討毛囊的發(fā)生、發(fā)展過程，為尋找有誘導(dǎo)毛發(fā)形成能力的種子細(xì)胞提供依據(jù)。
　　2.掌握體外構(gòu)建表皮-真皮組織工程皮膚的技術(shù)及明確移植后的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸，探討表皮-真皮組織工程皮膚的皮膚缺損修復(fù)以及毛發(fā)生長(zhǎng)能力。
　　3.尋找具有誘導(dǎo)毛發(fā)形成能力的種子細(xì)胞，明確其能維持誘導(dǎo)能力的培養(yǎng)方式及構(gòu)建方式，為構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程

4、皮膚奠定基礎(chǔ)。
　　4.構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程皮膚并修復(fù)皮膚缺損。
　　研究方法:
　　1.以C57BL/6不同胎齡胎鼠的皮膚為模型，通過HE染色觀察毛囊胚胎發(fā)育過程，免疫熒光染色標(biāo)記相關(guān)毛囊干細(xì)胞并觀察毛囊干細(xì)胞動(dòng)態(tài)衍變過程。
　　2.分離、培養(yǎng)兒童包皮表皮細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞，以自制SD大鼠鼠尾膠原為基質(zhì)，應(yīng)用氣-液面培養(yǎng)，構(gòu)建表皮-真皮組織工程皮膚。制備大鼠背部急性全層皮膚損傷模型，將構(gòu)建的表皮-真皮

5、組織工程皮膚覆蓋傷口，觀察其體內(nèi)轉(zhuǎn)歸。將原代培養(yǎng)的成人毛乳頭細(xì)胞與成人毛囊干細(xì)胞以上述方式制備組織工程皮膚，并進(jìn)行體內(nèi)移植觀察其轉(zhuǎn)歸。
　　3.將新鮮分離的C57BL/6新生鼠(24小時(shí)以內(nèi))真皮細(xì)胞、貼壁培養(yǎng)的原代真皮細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)的原代真皮細(xì)胞以及懸浮培養(yǎng)后吹打成單細(xì)胞懸液，和表皮細(xì)胞與鼠尾膠原蛋白混合，植入裸鼠背部制備的皮膚全層缺損處，三周后觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況并組織學(xué)染色觀察毛囊結(jié)構(gòu)。將C57BL/6成鼠胡須毛乳頭細(xì)胞P1代與

6、新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞制備成類似毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)3D培養(yǎng)后，植入C57BL/6小鼠腎外膜下，三周后進(jìn)行觀察。
　　4.將成人頭皮來源毛乳頭細(xì)胞、兒童包皮成纖維細(xì)胞、人神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞分別復(fù)合兒童包皮表皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，進(jìn)行2D或3D的構(gòu)建及培養(yǎng)方式，將其移植裸鼠體內(nèi)，驗(yàn)證不同種子細(xì)胞毛發(fā)形成能力的異同，尋找能穩(wěn)定誘導(dǎo)毛發(fā)形成的種子細(xì)胞。
　　5.以兒童包皮來源的表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，使用3D打印的方法

7、在表皮-真皮組織工程皮膚的真皮層中打印毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程皮膚;此外，還以人神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞混合兒童包皮來源的表皮細(xì)胞為種子細(xì)胞直接構(gòu)建有毛發(fā)生長(zhǎng)能力的組織工程皮膚;將構(gòu)建的組織工程皮膚移植裸鼠體內(nèi)修復(fù)皮膚缺損并觀察有無毛發(fā)生長(zhǎng)能力。
　　研究結(jié)果:
　　1.毛囊胚胎發(fā)育及相關(guān)毛囊干細(xì)胞動(dòng)態(tài)衍變過程
　　(1)HE染色顯示:C57BL/6小鼠從胚胎發(fā)育E14.5天開始出現(xiàn)表皮局部增厚，

8、形成基板，真皮細(xì)胞在下方聚集;E15.5天增厚的表皮細(xì)胞逐漸形成毛芽，基板下方聚集的真皮細(xì)胞開始被形成的毛芽包裹;E16.5-E17.5天毛芽進(jìn)一步發(fā)育，真皮細(xì)胞逐漸被毛芽包裹，形成毛囊的毛乳頭結(jié)構(gòu);E18.5天至出生后，繼續(xù)完成毛囊的胚胎發(fā)育，出生時(shí)毛囊的結(jié)構(gòu)基本形成。
　　(2)毛囊干細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記顯示:隨著毛囊發(fā)育和延長(zhǎng)，標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞呈時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　2.體外構(gòu)建的表皮-真皮組織工程皮膚
　　(1)體外

9、構(gòu)建的表皮-真皮組織工程皮膚氣-液面培養(yǎng)5天后，HE染色可觀察到表皮和真皮兩層結(jié)構(gòu)，且表皮呈現(xiàn)復(fù)層化。表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞狀態(tài)良好，分布均勻。膠原蛋白交織成網(wǎng)將成纖維細(xì)胞固定在基質(zhì)中。移植3周后，皮膚創(chuàng)口處完全愈合，與周圍組織緊密連接，未見毛發(fā);組織學(xué)顯示缺損處皮膚形成表皮、真皮雙層結(jié)構(gòu)，且表皮復(fù)層化，未見毛囊結(jié)構(gòu)。
　　(2)將原代培養(yǎng)的成人毛乳頭細(xì)胞與成人毛囊干細(xì)胞以上述方式制備的組織工程皮膚植入裸鼠體內(nèi)三周后也未見毛發(fā)生長(zhǎng)，

10、組織學(xué)染色觀察未見毛囊結(jié)構(gòu)。
　　3.尋找具有誘導(dǎo)毛囊形成能力的種子細(xì)胞
　　(1)新鮮分離的C57BL/6新生鼠真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞與鼠尾膠原蛋白混合，植入裸鼠背部制備的皮膚全層缺損處三周后可見黑色毛發(fā)生長(zhǎng)。
　　(2)貼壁培養(yǎng)的原代真皮細(xì)胞組，三周后未見毛發(fā)生長(zhǎng)，組織學(xué)染色未見毛囊結(jié)構(gòu);而在懸浮培養(yǎng)的原代真皮細(xì)胞組，三周后可見黑色毛發(fā)生長(zhǎng);懸浮培養(yǎng)的原代真皮細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液組，三周后無毛發(fā)生長(zhǎng)。提示3D懸浮培養(yǎng)可

11、保留新生鼠原代真皮細(xì)胞的誘導(dǎo)毛發(fā)形成能力。
　　(3)C57BL/6成鼠胡須毛乳頭細(xì)胞P1代與新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞制備成類似毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)3D培養(yǎng)后，植入C57BL/6小鼠腎外膜下三周后可見黑色毛發(fā)生長(zhǎng)，組織學(xué)染色觀察見毛囊結(jié)構(gòu)。
　　(4)成人毛乳頭細(xì)胞P1與新鮮分離的兒童包皮表皮細(xì)胞制備成類似毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)3D培養(yǎng)后，移植至裸小鼠背部皮膚皮下觀察3周，見白色毛纖維生長(zhǎng)。
　　(5)兒童包皮成纖維細(xì)胞P1

12、與新鮮分離的兒童包皮表皮細(xì)胞制備成類似毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)3D培養(yǎng)后，移植至裸小鼠背部皮下觀察3周，見白色毛纖維生長(zhǎng)。植入皮內(nèi)，導(dǎo)絲引導(dǎo)，三周后有白色毛纖維長(zhǎng)出，經(jīng)線粒體DNA檢測(cè)毛發(fā)含有人類源性的DNA。
　　(6)人神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞、新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞與鼠尾膠原蛋白混合，植入裸鼠背部皮下能長(zhǎng)出黑色毛發(fā)。入神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞、新鮮分離的兒童包皮來源表皮細(xì)胞與鼠尾膠原蛋白混合，植入裸鼠背部皮下能長(zhǎng)出黑色毛發(fā)。

13、
　　4.構(gòu)建帶有毛囊的表皮-真皮組織工程皮膚
　　(1)使用3D打印方法在表皮-真皮組織工程皮膚的真皮層中打印含兒童包皮來源表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，將構(gòu)建的組織工程皮膚移植到裸鼠背部全層皮膚缺損處，三周后可見白色毛發(fā)。
　　(2)人神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞與新鮮分離的兒童包皮表皮細(xì)胞混合制備組織工程皮膚，皮下移植及移植到裸鼠背部全層皮膚缺損處，三周后可見黑色毛發(fā)。
　　研究結(jié)論:
　　1.

14、毛囊胚胎發(fā)育及相關(guān)毛囊干細(xì)胞動(dòng)態(tài)衍變過程
　　毛囊胚胎發(fā)育進(jìn)一步確認(rèn)了毛囊的胚胎發(fā)育是表皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞相互作用的結(jié)果，E14.5-E17.5是C57BL/6毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間。
　　2.構(gòu)建表皮-真皮組織工程皮膚
　　(1)體外構(gòu)建的表皮-真皮組織工程皮膚經(jīng)氣-液面培養(yǎng)5天后呈現(xiàn)表皮、真皮雙層結(jié)構(gòu)，表皮呈現(xiàn)復(fù)層化。體外移植至裸鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型能使皮膚創(chuàng)口的愈合良好。
　　(2)培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞以單細(xì)胞

15、的方式接種于真皮層中表皮-真皮組織工程皮膚體內(nèi)移植后不具備形成毛發(fā)的能力。
　　3.尋找能夠誘導(dǎo)毛發(fā)形成的種子細(xì)胞
　　(1)能夠誘導(dǎo)毛發(fā)形成的細(xì)胞制備成類似毛囊樣3D結(jié)構(gòu)，并經(jīng)3D培養(yǎng)后，可較好的維持其誘導(dǎo)毛囊形成的能力。
　　(2)兒童包皮的成纖維細(xì)胞與表皮細(xì)胞制備成類似毛囊樣的3D結(jié)構(gòu)具有誘導(dǎo)毛發(fā)形成的能力，但是所生長(zhǎng)出的毛發(fā)不含黑色素。
　　(3)人神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)的毛乳頭細(xì)胞具有良好的誘導(dǎo)毛發(fā)形成的能力，