西紅花（Crocus sativus）7，8-二加氧酶基因（CsZCD）的克隆表達(dá)、西紅花甙的藥理作用及藥材的鑒別研究.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文西紅花（Crocussativus）7，8二加氧酶基因（CsZCD）的克隆表達(dá)、西紅花甙的藥理作用及藥材的鑒別研究姓名：唐琳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：陳放20041030pU川大學(xué)博J二學(xué)位論文己知西紅花酸合成酶基因序列高度同源(同源性99％)命名為CsZCD。另～個的同源性為96％，命名為CsZCDNEgo將CsZCD連接到pBIl21質(zhì)粒上構(gòu)建成植物表達(dá)型載體pBIl2卜CsZCD。該工作為研究其在

2、植物中的生物合成能力打下了基礎(chǔ)。為擴(kuò)大西紅花甙來源和尋找新的資源，本研究將克隆到的西紅花酸合成酶基因CsZCD和CsZCD^匹堿分別克隆到表達(dá)載體pQE31上，得到重組質(zhì)粒pQE31CsZCD和pQE一31一蚴刪。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡coTiM15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出了N端融合了6His的融合蛋白，其表達(dá)量占菌體總蛋白的137％和144％aSDS—PAGE和Westernblot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為49kD和52KD。

3、融合蛋白以包涵體的形式存在，將其變性后經(jīng)HisTrap“HP柱親和純化，以期得到蛋白，制備抗體。按照新藥臨床前毒理研究規(guī)范，通過小鼠和大鼠在不同劑量下先后進(jìn)行灌服或注射的急性毒性實驗和長期毒性實驗。結(jié)果表明，西紅花甙長期用藥毒性很小。用西紅花甙配制最大濃度0Ig／ml，小鼠209體重每日一次灌胃1Oml；小鼠腹腔注射給藥，測定半致死量(LD。)：以SD大鼠分為對照組及西紅花甙300mg、tOOmg、33mg／kg劑量組(分別為人用量的2

4、00、66、20倍)，連續(xù)灌胃給藥三個月，觀察西紅花甙對動物毒理學(xué)各項指標(biāo)的影響。實驗結(jié)果表明：小鼠灌服西紅花甙的最大耐受量為59／kg，相當(dāng)于臨床用量的500倍：LD。為20054g／kg：西紅花甙高劑量(300mg／kg)組血液學(xué)指標(biāo)RBC、Hb及HCT顯著降低，MCH，MCHC顯著升高，恢復(fù)期(停藥三周)上述指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，另外兩個劑量組血液學(xué)RBC、Hb、HCT、MCH及MCHC指標(biāo)未見異常西紅花甙各組對血液學(xué)其它指標(biāo)、體重

5、、攝食、腦、心、肝、腎、十二項血清生化指標(biāo)及心電圖等均無明顯影響，各臟器大體及鏡下檢查均未見明顯中毒性病理改變。為觀察西紅花甙對局灶性腦缺血的治療作用，用電凝法阻斷大鼠腦中動脈，造成局灶性腦缺血模型，十二指腸給藥，觀察西紅花甙對局灶性腦缺血的治療作用。結(jié)果表明，與模型組比較，西紅花甙組大鼠腦梗塞灶明顯縮小腦梗塞后動物的神經(jīng)行為障礙明顯減輕，腦指數(shù)明顯降低，血清SOD活性來見明顯改變，斟DA含量明顯降低，病理學(xué)檢查表明，腦組織壞死及水腫區(qū)