巴馬汀降脂活性及作用機(jī)理研究.pdf

1、黃連在中國傳統(tǒng)主要用于感染性疾病的預(yù)防和治療，生物堿類成分是其主要的活性成分，主要包括小檗堿、巴馬汀、黃連堿和表小檗堿。其中，小檗堿的降脂活性已經(jīng)在動(dòng)物及臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。本課題組前期研結(jié)果表明黃連主要生物堿在昆明鼠中經(jīng)口途徑的半數(shù)致死量(median lethaldose，LD50)由高到低的順序?yàn)?巴馬汀(1533mg/kg)＞表小檗堿(1360mg/kg)＞黃連堿(852mg/kg)＞小檗堿(712mg/kg)，由此可見巴馬汀的

2、安全性比其他主要的黃連生物堿要高，是否巴馬汀像小檗堿一樣具有降脂活性仍是未知。為了弄清巴馬汀的降脂活性及作用機(jī)理，為巴馬汀進(jìn)一步綜合開發(fā)利用做好鋪墊，本課題對黃連的根莖和須根中的主要生物堿類成分的組成及含量進(jìn)行了比較，成功從黃連根莖中分離制備得到了純度較高的巴馬汀單體，并通過高脂血癥金黃地鼠模型對巴馬汀的降脂活性及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果如下:
　　1.黃連根莖和須根中生物堿類成分組成及含量的比較
　　通過高效液相

3、色譜法同時(shí)比較了黃連根莖及須根中主要生物堿類成分的分布情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃連根莖及須根中均含有小檗堿、巴馬汀、黃連堿和表小檗堿，但是生物堿含量有所差異。其中，黃連根莖部位小檗堿含量為5.61％、巴馬汀含量為1.48％、黃連堿含量為1.74％、表小檗堿含量為0.72％。在黃連的須根部位，小檗堿含量為1.20％、巴馬汀含量為0.08％、黃連堿含量為1.28％、表小檗堿含量為0.53％。由此看出，雖然黃連根莖及須根部位均含有生物堿

4、類成分，但是就總生物堿含量而言，黃連根莖部位的總生物堿含量大于黃連須根部位總生物堿含量。就單體分布情況而言，黃連根莖以小檗堿的含量最高，以表小檗堿的含量最低;黃連須根以黃連堿的含量最高，以巴馬汀的含量最低。
　　2.黃連根莖中巴馬汀單體的制備
　　取經(jīng)過干燥的黃連根莖10kg進(jìn)行粉碎后，用70％乙醇于室溫下冷浸提取三次，每次提取24h，固液比為1∶10。將連續(xù)三次冷浸提取得到的黃連生物堿提取液合并、通過減壓蒸餾回收乙醇，即可

5、得到黃連醇提物，經(jīng)過真空干燥后稱重，并計(jì)算黃連生物醇提物提取得率。采用高速逆流色譜法從黃連醇提物中分離出巴馬汀成分。具體的高速逆流色譜條件為:采用高速逆流色譜儀，以氯仿-甲醇-0.2 mol/L鹽酸(4∶1.5∶2，v/v/v)為溶劑體系，流動(dòng)相的流速為2.0mL/min，檢測波長為254nm，主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r/min，恒溫循環(huán)溫度為25℃。在該高速逆流色譜條件下將制備得到的黃連醇提物浸膏進(jìn)行巴馬汀單體的分離。高速逆流色譜分離的流出液

6、分部收集，6min/管。用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）對收集的流分進(jìn)行檢測，采用的展開系統(tǒng)為:環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，v/v/v/v/v/v)，檢視波長為345nm。將含巴馬汀色譜峰的流出液合并、濃縮、真空干燥至干，即得到巴馬汀粗提物。將制備得到的巴馬汀粗提物上葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱進(jìn)一步分離純化得到巴馬汀單體，并計(jì)算巴馬

7、汀單體的提取得率。采用質(zhì)譜法測定巴馬汀的分子量，采用光譜法對巴馬汀進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，通過HPLC檢測了巴馬汀單體的純度。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過乙醇回流得到的黃連醇提物提取得率為36％，通過高速逆流色譜法及葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱聯(lián)合制備得到的巴馬汀單體產(chǎn)率為4％。通過HPLC檢測制備得到的巴馬汀單體的純度，結(jié)果表明從黃連根莖中制備得到的巴馬汀單體純度可以達(dá)95％。
　　3.巴馬汀體內(nèi)降脂活性的研究
　　通

8、過金黃地鼠連續(xù)4周自由采食高脂飼料建立高脂血癥模型，并通過測定血脂水平判定所建立的高脂血癥模型成功以否。成功建立高脂血癥動(dòng)物模型后，將高脂血癥金黃地鼠隨機(jī)分為模型組、巴馬汀低劑量組(23.35mg/kg)、巴馬汀中劑量組（46.70mg/kg）、巴馬汀高劑量組（70.05mg/kg）、辛伐他汀陽性對照組(1.2mg/kg)。各個(gè)試驗(yàn)組中金黃地鼠均為10只。另外取10只采食基礎(chǔ)飼料的金黃地鼠作為正常組。通過灌胃途徑給藥，干預(yù)治療時(shí)間為4周

9、。于試驗(yàn)?zāi)┢冢B續(xù)收集各組金黃地鼠于72h內(nèi)排泄的糞便，用于總膽汁酸(total bile acids，TBA)及TC的含量分析;采血用于血脂測定;收集肝臟和回腸用于降脂機(jī)制的研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴馬汀可顯著降低高脂血癥金黃地鼠異常升高的血脂水平，同時(shí)還可促進(jìn)金黃地鼠糞便中TC和TBA的排泄。
　　4.巴馬汀體內(nèi)降脂機(jī)制的研究
　　通過檢測高脂血癥金黃地鼠肝臟部位羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-

10、methyl glutaryl coenzymeA reductase，HMGR）、低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）和膽固醇7α-羥化酶(cholesterol7α-hydroxylase，CYP7A1)的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)及蛋白表達(dá)以及回腸部位頂端Na+/膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(apical Na+-bile acid tr

11、ansporter，ASBT)的mRNA及蛋白表達(dá)來探索巴馬汀的降脂機(jī)制。
　　實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chainreaction，qRT-PCR)檢測結(jié)果表明:與正常組比，模型組高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGR mRNA的表達(dá)無顯著性變化(P＞0.05);肝臟部位LDLR mRNA的表達(dá)顯著降低了70％(P＜0.01)，肝臟部位CYP7A1 mRNA的表

12、達(dá)顯著降低了67％(P＜0.01);回腸部位ASBT mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)了近2倍(P＜0.01)。通過巴馬汀干預(yù)治療4周后，與模型組比，巴馬汀在低劑量(23.35mg/kg)、中劑量（46.70mg/kg）和高劑量（70.05mg/kg）時(shí)對高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGRmRNA表達(dá)無顯著影響(P＞0.05);巴馬汀在低劑量（23.35mg/kg）、中劑量(46.70mg/kg)和高劑量(70.05mg/kg)時(shí)均可顯著上調(diào)高脂血

13、癥金黃地鼠肝臟部位LDLR mRNA的表達(dá)（P＜0.01或0.05），巴馬汀為高劑量（70.05mg/kg）時(shí)，可上調(diào)LDLR mRNA表達(dá)達(dá)到2.3倍;巴馬汀在低劑量(23.35mg/kg)、中劑量(46.70mg/kg)和高劑量(70.05mg/kg)時(shí)均可顯著上調(diào)高脂血癥金黃地鼠肝臟部位CYP7A1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01或0.05)，巴馬汀為高劑量(70.05mg/kg)時(shí)，可上調(diào)CYP7A1 mRNA表達(dá)達(dá)到2.0倍;巴

14、馬汀為中劑量(46.70mg/kg)和高劑量(70.05mg/kg)時(shí)可顯著抑制高脂血癥金黃地鼠回腸部位ASBT mRNA的表達(dá)(P＜0.01或0.05)，巴馬汀為高劑量(70.05mg/kg)時(shí)可顯著抑制ASBT mRNA表達(dá)，抑制率達(dá)44％。QRT-PCR結(jié)果還表明與模型組比，陽性對照藥物辛伐他汀可顯著抑制高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGR mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，抑制率達(dá)到55％，此外，辛伐他汀也可以顯著上調(diào)金黃地鼠肝臟部位

15、LDLR mRNA的表達(dá)達(dá)到2.0倍(P＜0.01)。辛伐他汀對高脂血癥金黃地鼠肝臟部位CYP7A1 mRNA及回腸部位ASBT mRNA表達(dá)均無顯著影響(P＞0.05)。蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測結(jié)果表明:與正常組比，模型組的高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGR的蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05);肝臟部位LDLR的蛋白表達(dá)顯著降低了54％(P＜0.01)，肝臟部位CYP7A1的蛋白表達(dá)顯著降低了50％(P＜0.01)

16、;回腸部位ASBT的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)了近2.4倍(P＜0.01)。通過巴馬汀干預(yù)治療4周后，發(fā)現(xiàn)巴馬汀在低劑量(23.35mg/kg)、中劑量（46.70mg/kg）和高劑量（70.05mg/kg）時(shí)對高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGR蛋白表達(dá)均無顯著影響(P＞0.05);巴馬汀在低劑量(23.35mg/kg)、中劑量(46.70mg/kg)和高劑量(70.05mg/kg)時(shí)均可顯著上調(diào)高脂血癥金黃地鼠肝臟部位LDLR蛋白的表達(dá)（P＜0.

17、01或0.05），巴馬汀為高劑量（70.05mg/kg）時(shí)，可上調(diào)LDLR蛋白表達(dá)達(dá)到1.7倍;巴馬汀在低劑量（23.35mg/kg）、中劑量（46.70mg/kg）和高劑量(70.05mg/kg)時(shí)均可顯著上調(diào)高脂血癥金黃地鼠肝臟部位CYP7A1蛋白的表達(dá)（P＜0.01或0.05），巴馬汀為高劑量（70.05mg/kg）時(shí)，可上調(diào)CYP7A1蛋白表達(dá)達(dá)到1.8倍;巴馬汀為中劑量(46.70mg/kg)、高劑量(70.05mg/kg)時(shí)

18、均可顯著抑制高脂血癥金黃地鼠回腸部位ASBT蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，巴馬汀為高劑量(70.05mg/kg)時(shí)可顯著抑制ASBT蛋白表達(dá)，抑制率達(dá)49％。Western blot結(jié)果還表明陽性對照藥物辛伐他汀可顯著抑制高脂血癥金黃地鼠肝臟部位HMGR蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)到33％，此外，辛伐他汀也可以上調(diào)高脂血癥金黃地鼠肝臟部位LDLR蛋白的表達(dá)達(dá)到1.5倍，尚未發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對高脂血癥金黃地鼠肝臟部位CYP7A1蛋白表達(dá)及回腸部位ASB