5-羥色胺對冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和竇房結(jié)自律性的影響.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 5-羥色胺促人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的研究
　　目的：觀察不同濃度5-羥色胺(5-HT)對體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hCASMC)增殖、遷移的影響及作用機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)hCASMC，予以不同濃度(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/l)的5-HT，觀察各種濃度的5-HT對hCASMC的增殖能力(MTT法)和遷移能力（遷移

2、小室法）。分別給予5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)抑制劑氟西汀(10-5 mol/l)、西酞普蘭((10-6 mol/l)和5-HT受體(5-HTR)阻斷劑GR127935(10-6 mol/l)、ketanserin(10-7 mol/l)，觀察5-HTT和5-HTR阻斷劑在5-HT誘導(dǎo)的hCASMC增殖遷移中的作用。通過高效氣相液相色譜檢測胞質(zhì)內(nèi)5-HT含量，觀察5-HTT阻斷劑對于胞內(nèi)5-HT含量的影響。使用重組腺病毒5-HTT編碼

3、基因載體過表達(dá)hCASMC5-HTT，觀察過表達(dá)5-HTT對5-HT誘導(dǎo)的hCASMC增殖、遷移的影響。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞生長良好，形態(tài)多樣，多數(shù)呈典型纖維樣細(xì)胞，呈梭形、長梭形、或帶狀，細(xì)胞伸出較長突起相互接觸，少數(shù)呈三角形或星型，核卵圓形居中，SM-α-肌動(dòng)蛋白鑒定陽性。(2)不同濃度5-HT對hCASMC的增殖活力相比較，結(jié)果顯示:與對照組相比，濃度為10-7 mol/l的5-HT的誘導(dǎo)下細(xì)胞增殖活力增加(P＜0.01)

4、，促增殖作用在10-5mol/l時(shí)達(dá)頂峰，5-HT濃度超過10-5mol/l時(shí)細(xì)胞增殖率開始下降。(3)5-HTT阻斷劑氟西汀或西酞普蘭均可有效抑制5-HT誘導(dǎo)的hCASMC增殖和遷移，與5-HT組相比有顯著性差異(P＜0.01)，這一作用可能與hCASMC胞內(nèi)攝入的5-HT減少相關(guān);5-HTR拮抗劑GR127935和ketanserin對5-HT誘導(dǎo)的hCASMC增殖無明顯影響。(4)過表達(dá)5-HTT基因的hCASMC對5-HT誘導(dǎo)的

5、細(xì)胞增殖、遷移作用顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：5-HT明顯促進(jìn)hCASMC增殖和遷移，5-HTT在5-HT誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用。
　　第二部分 5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體在血管損傷后的表達(dá)變化及調(diào)控因素
　　目的：檢測血管損傷發(fā)生時(shí)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)的表達(dá)和炎癥因子對其的調(diào)控作用。
　　方法：使用大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，western blot檢測發(fā)生損傷后狹窄段頸動(dòng)脈白細(xì)

6、胞介素1-beta(IL-1β)和5-HTT表達(dá)。給予IL-1β(10 ng/ml)及IL-1受體拮抗劑(IL-1ra10 ng/ml)干預(yù)體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hCASMC)，檢測其對5-HTT表達(dá)的影響。給予IL-1β干預(yù)表達(dá)5-HTT的HEK293細(xì)胞，膜片鉗檢測5-HT誘導(dǎo)的電流，檢測IL-1β對5-HTT功能的影響。
　　結(jié)果：(1)球囊損傷損傷3天后，新生內(nèi)膜開始形成，7天后新生內(nèi)膜已經(jīng)形成并增厚，以后血管平

7、滑肌細(xì)胞繼續(xù)增生，內(nèi)膜繼續(xù)增厚。(2)頸動(dòng)脈球囊損傷后組織IL-1β表達(dá)增加，于第7天達(dá)到高峰，第21天仍明顯高于對照組(p＜0.05);5-HTT表達(dá)增加，于14天達(dá)到高峰(p＜0.05)。(3) IL-1β上調(diào)hCASMC5-HTT表達(dá)，增強(qiáng)HEK293-5-HTT細(xì)胞5-HT誘導(dǎo)電流，IL-1受體拮抗劑可抑制這一作用。
　　結(jié)論：5-HTT和IL-1β在血管損傷后狹窄過程中表達(dá)增加;而IL-1β可以上調(diào)5-HTT表達(dá)和促進(jìn)5

8、-HTT功能。
　　第三部分 心肌蛋白5-羥色胺化修飾及其對竇房結(jié)細(xì)胞自律性影響研究
　　目的：檢測并篩選心肌細(xì)胞受5-羥色胺化作用的靶點(diǎn)，通過生物仿真預(yù)測和分析其對竇房結(jié)自律性的影響及機(jī)制。
　　方法：分離單個(gè)大鼠心肌細(xì)胞，分為四組:a:心肌細(xì)胞未與5-HT孵育且加入了轉(zhuǎn)谷酰胺酶抑制劑(Dansylcadaverine，DSC)和鈣離子螯合劑EGTA，b:心肌細(xì)胞以1mM5-HT和6.7 mM CaCl2處理，c:心

9、肌細(xì)胞預(yù)先給予0.2mMDSC孵育10min后再加入1 mM5-HT處理，d:心肌細(xì)胞預(yù)先給予5mMEGTA后再加入1mM5-HT處理。提取蛋白，使用5-HT抗體和Protein A Agarose進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫共沉淀、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和快速銀染，選擇符合5-羥色胺化特點(diǎn)的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。應(yīng)用竇房結(jié)計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)心臟模型，對所篩選的蛋白進(jìn)行生物仿真，探討其對竇房結(jié)節(jié)律的影響和機(jī)制。
　　結(jié)果：分離的大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞

10、表面光滑、邊緣和橫紋清晰，細(xì)胞呈長桿狀，具有良好透光度。5-羥色胺化檢測發(fā)現(xiàn)分子量100 kDa附近一條帶蛋白量受DSC和EGTA影響明顯減少，提示為符合5-羥色胺化特征的蛋白質(zhì)條帶。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析鑒定目的條帶為肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣三磷酸腺苷酶2a(SERCA2a)。利用竇房結(jié)細(xì)胞計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)模型的仿真提示SERCA正向鈣親和力降低或反向鈣親和力增加以及輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏引起竇房結(jié)節(jié)律增快，反之SERCA正向鈣親和力增加或反向鈣親和力降低以及嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)