人谷氨酰半胱氨酸合成酶通過(guò)抑制JNK防止紫外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的研究.pdf

1、細(xì)胞死亡通路對(duì)于胚胎發(fā)育和正常組織穩(wěn)態(tài)的維持是必需的。在分子水平，細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的調(diào)控。凋亡不足或過(guò)量凋亡都會(huì)引起各種疾病的發(fā)生比如：腫瘤、自體免疫性疾病或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。因此，細(xì)胞凋亡在生物醫(yī)藥科學(xué)研究中也己成為重要的研究領(lǐng)域。對(duì)凋亡信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究為各種疾病的治療提供了新的思路。 為研究谷胱甘肽合成酶類(lèi)谷氨酰半胱氨酸合成酶對(duì)紫外誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞死亡的影響，本實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分： 一：谷胱甘

2、肽合成酶類(lèi)基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá) 通過(guò)PCR技術(shù)從人eDNA庫(kù)中擴(kuò)增出GCLC(谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基)和GSS(谷胱甘肽合成酶)，并分別將他們插到真核和原核質(zhì)粒的MCS位點(diǎn)中。利用這些重組載體的構(gòu)建能夠?yàn)橄乱徊窖芯縂CLC對(duì)紫外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響做好基礎(chǔ)。構(gòu)建的原核重組載體分別用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)能夠得到大量表達(dá)的目的蛋白，也可為兩種蛋白抗體的制備做好準(zhǔn)備，從而在將來(lái)的工作里能夠有效的檢測(cè)到內(nèi)源和外源蛋白表達(dá)的變化。

3、 二:人谷氨酰半胱氨酸合成酶防止紫外刺激誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞死亡的機(jī)制研究 人的谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y-GCS)是谷胱甘肽合成的限速酶，而GCLC具有Y-GCS所有的催化活性。從形態(tài)上觀察GCLC能夠顯著地抑制紫外刺激誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的死亡。MTS實(shí)驗(yàn)和FACS檢測(cè)的結(jié)果也表明GCLC和JNK1APF的表達(dá)能夠提高細(xì)胞對(duì)紫外刺激的耐受性。通過(guò)Westernblotting技術(shù)檢測(cè)到UV能夠強(qiáng)烈的激活JNK、p