α-硫辛酸對半胱氨酸誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷后賴氨酰氧化酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的:通過半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷后賴氨酰氧化酶(LOX)的表達(dá)變化及α-硫辛酸(ALA)對LOX的調(diào)節(jié)作用,探討ALA對內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及其機(jī)制,為ALA防治內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.將HUVEC-12細(xì)胞株進(jìn)行人工傳代培養(yǎng)。
　　 2.加入不同濃度Hcy、ALA培養(yǎng)不同時間,用MTT法測定細(xì)胞存活量。
　　 3.運用共聚焦顯微鏡觀察不同濃度Hcy、ALA對

2、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成及清除情況。
　　 4.提取細(xì)胞RNA,RT-PCR后以MMP-2、LOX與β-actin的mRNA比值進(jìn)行半定量分析。
　　 5.提取細(xì)胞蛋白,以LOX與β-actin的OD比值進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞存活有明顯抑制作用。不同濃度Hcy處理后,細(xì)胞明顯受抑制,呈濃度依賴性(P＜0.01)。經(jīng)Hcy處理后加入不同劑量ALA,細(xì)胞存活量明顯上升,不同

3、組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.Hcy能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS,胞內(nèi)ROS含量隨Hcy濃度增加而升高。以Hcy處理后分別加入不同劑量ALA,胞內(nèi)ROS含量明顯減少,不同組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.Hcy呈濃度依賴性下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞LOX表達(dá)及上調(diào)MMP-2mRNA表達(dá)。RT-PCR結(jié)果提示予不同濃度Hcy處理后LOXmRNA表達(dá)明顯減少,呈濃度依賴性(P＜0.01)。MMP-2mRNA

4、表達(dá)隨Hcy濃度增加而升高。應(yīng)用LOX抑制劑BAPN后,MMP-2mRNA表達(dá)明顯增加。除Hcy中、高濃度組外,其余各組間差異均具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果提示LOX表達(dá)隨Hcy濃度增加而降低。不同組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.ALA可抑制Hcy刺激引起LOX表達(dá)下調(diào)及MMP-2上調(diào)。RT-PCR結(jié)果提示經(jīng)Hcy處理后分別加入不同劑量ALA,細(xì)胞LOXmRNA相對表達(dá)量呈上升趨勢。

5、MMP-2mRNA表達(dá)較Hcy組降低,應(yīng)用BAPN后,MMP-2mRNA表達(dá)增加。不同組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果提示經(jīng)Hcy處理與加入ALA后比較,Hcy組細(xì)胞LOX蛋白明顯低于ALA組。經(jīng)重復(fù)測量方差分析,不同組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.ALA明顯增高受損內(nèi)皮細(xì)胞活性,提示ALA對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　 2.Hcy可通過增加細(xì)胞胞內(nèi)

6、ROS生成引起內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。予ALA干預(yù)后胞內(nèi)ROS含量下降,提示ALA可通過減少內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成,改善細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　 3.Hcy引起內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)增加,可能是通過Hcy下調(diào)細(xì)胞LOX表達(dá)來實現(xiàn)的。提示Hcy可通過抑制細(xì)胞LOX表達(dá)引起MMP-2表達(dá)異常,促使ECM降解、改變血管壁彈性,從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,這可能是Hcy引起動脈粥樣硬化的重要機(jī)制。
　　 4.ALA可干預(yù)