山藥提取物對人冠狀動脈與主動脈內皮細胞TIPE2與PCNP基因表達的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）是一類主要累及大、中動脈的動脈硬化性疾病，表現為動脈的內膜層的脂質沉積、脂紋形成、粥樣斑塊、斑塊破裂出血、血栓形成等一系列病理變化，最終導致血管管腔慢性狹窄甚至血栓形成發(fā)生急性閉塞，危及生命。隨著其發(fā)病率的逐年增加，科學家對AS的研究也越來越深入、越來越廣泛，發(fā)病機制眾說紛紜，但目前得到廣泛認同的主要有兩種學說：炎癥學說和內皮損傷學說，認為炎癥因子和免疫反應在AS發(fā)病的整個過程中均起

2、到至關重要的作用。
　　山藥營養(yǎng)豐富，價格低廉，既能作為食物供人們食用，又能作為藥物用于疾病的治療，自古以來都受到人們的喜愛。以山藥提取物（Dioscorease rhizome extract, DRE）為主要成分的藥物制品也已在臨床應用多年，主要用于高血脂、冠心病等動脈粥樣硬化性疾病的預防與治療。但在臨床上缺乏大型的臨床試驗為其提供循證醫(yī)學證據，在分子機制方面的研究更是少有，因此山藥抗動脈粥樣硬化的機制尚不明確。
　　P

3、CNP（PEST-containing nuclear protein）是一類新近發(fā)現的核蛋白，也是一種親水性的蛋白，其結構中富含PEST序列，是NIRF的底物，容易被NIRF介導泛素化，從而被蛋白酶降解，因此其半衰期較短，相對較不穩(wěn)定。研究發(fā)現，PCNP參與細胞周期的調控過程及腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展進程，在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展中可能也起到一定的調節(jié)作用。TIPE2（tumor necrosisfactor-α-induced pr

4、otein8-like2）是新近發(fā)現的對細胞凋亡起調節(jié)作用的蛋白，研究發(fā)現其對先天性免疫及獲得性免疫具有負性調節(jié)作用，并參與維持機體的免疫內穩(wěn)態(tài)。由于在抗菌免疫機制中亦產生負性調節(jié)作用，過表達可能會促進細菌感染后炎癥反應的發(fā)生，造成嚴重的全身炎癥反應。同時還發(fā)現TIPE2參與多種腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展進程。近期的研究發(fā)現巨噬細胞中的TIPE2通過對免疫反應起到負性調節(jié)作用，從而對動脈粥樣硬化進程具有一定的抑制作用。
　　本實驗預從D

5、RE入手，探討在人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cell, HCAEC）及主動脈內皮細胞（human aortic endothelial cell, HAEC）中PCNP與TIPE2的表達量是否隨著DRE濃度的變化而變化，以及兩種細胞內的蛋白表達是否有差異，為進一步研究DRE與AS的關系及新藥的開發(fā)提供理論依據。
　　目的:通過檢測HCAEC及HAEC內PCNP與TIPE2

6、的表達量隨DRE濃度的變化情況，探討DRE與AS的關系。
　　方法:將DRE用DMEM細胞培養(yǎng)液完全溶解制得10mg/ml的DRE原液，再將DRE原液稀釋為如下三種濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，分別培養(yǎng)HCAEC及HAEC24h、48 h、72 h，并設置對照組（0μg/ml）。通過MTT法繪制細胞生長曲線，檢測不同濃度DRE對兩種細胞生長的影響；提取細胞內的RNA，反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR（R

7、eal time-PCR，RT-PCR）法檢測不同濃度DRE培養(yǎng)兩種細胞，經過不同時間后細胞內PCNP和TIPE2基因表達的變化；通過免疫印跡法（Western Blotting）檢測經過DRE培養(yǎng)后HCAEC和HAEC細胞內PCNP和TIPE2蛋白的表達量的變化。
　　結果:MTT結果顯示：不同濃度的DRE對HCAEC和HAEC細胞的生長未產生明顯影響（P＞0.05）；RT-PCR結果顯示：PCNP的表達量不受藥物濃度、細胞種類

8、及培養(yǎng)時間的影響（P＞0.05），TIPE2的表達量不受細胞種類及培養(yǎng)時間的影響（P＞0.05），與DRE濃度呈正相關，濃度越大TIPE2表達量越多，相反濃度越小TIPE2表達量越少（P＜0.05）；Western Blotting結果顯示：PCNP蛋白表達量不受藥物濃度、細胞種類及培養(yǎng)時間的影響（P＞0.05），TIPE2蛋白表達量不受細胞種類及培養(yǎng)時間的影響（P＞0.05），與DRE濃度有關，濃度越大TIPE2表達量越多（P＜0.0