甲醛對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、近年來,有研究提出內(nèi)源性甲醛(FA)可能是啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素。內(nèi)源性甲醛是人體內(nèi)甲胺(MA)氧化脫氨的代謝產(chǎn)物,研究表明甲胺本身對(duì)血管內(nèi)皮相對(duì)無毒,但在SSAO催化下,其脫氨產(chǎn)物可引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞株CPA47損傷,但有關(guān)血漿中內(nèi)源性甲醛濃度及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性作用的量效關(guān)系數(shù)據(jù)仍未見報(bào)道。本研究通過改良KCl-SDS沉淀法測(cè)定蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)(DPC)、乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)膜完整性,利

2、用倒置相差顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架的完整性各指標(biāo),從細(xì)胞水平研究血液中內(nèi)源性甲醛濃度與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是否存在直接關(guān)系。
　　主要研究?jī)?nèi)容和方法:
　　一、大鼠主動(dòng)脈“環(huán)”植塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,在取出大鼠胸主動(dòng)脈時(shí)進(jìn)行了血管外膜的瞬間熱處理(60℃,2s),并通過S-P免疫組化染色檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　二、通過免疫組化染色比較了瞬間熱處理與無

3、熱處理對(duì)早期植塊培養(yǎng)過程中遷出內(nèi)皮細(xì)胞純度的影響。
　　三、取3-4代大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,用含不同濃度甲醛(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mM)的無血清培養(yǎng)基,孵育1.5h;及含0.05、0.1mM甲醛的無血清培養(yǎng)基加入后各孵育0、0.5、1、1.5、2、4h,收集細(xì)胞,用改良KCl-SDS沉淀法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)(DPC)。
　　四、不同濃度甲醛孵育1.5h;及用含0.05、0.1mM甲醛的無血

4、清培養(yǎng)基孵育不同時(shí)間后收集培養(yǎng)基上清,乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中酶活性。
　　五、不同濃度甲醛孵育1.5h后倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。
　　六、不同濃度甲醛孵育1.5h后,FITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin,激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變。
　　研究結(jié)果:
　　一、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈多角形或梭形,呈鵝孵石鑲嵌排列。免疫組化S-P法檢查Ⅷ因子相關(guān)抗原,胞漿中有棕黃色著

5、色,即呈陽性反應(yīng)。
　　二、熱處理組內(nèi)皮細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)比率(±s)為0.678±0.154,對(duì)照組為0.431±0.194。與無熱處理法比較,瞬間熱處理使植塊培養(yǎng)法的內(nèi)皮細(xì)胞純度顯著提高(P<0.05)。
　　三、濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mM甲醛作用1.5h,交聯(lián)率(±s)分別為1.43±0.63、2.17±1.44、3.27±1.26、6.23±3.22、8.12±2.49、9.57±1.87、

6、13.34±1.82％。0.5-2mM甲醛作用1.5h后引起 DPC形成明顯增高(P<0.05)。0.5mM組比0.01mM組交聯(lián)率升高(P<0.05);1mM組比0.01、0.05mM組交聯(lián)率明顯升高(P<0.01)而0.5mM與1mM組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2mM組交聯(lián)率比各低劑量組高,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。濃度為0.05mM的甲醛作用0、0.5、1、1.5、2、4h,交聯(lián)率(±s)分別為1.18±0.29、3.07±

7、0.37、3.13±0.68、3.27±1.26、6.93±0.73、10.15±2.91%;濃度為0.1mM的甲醛作用0、0.5、1、1.5、2、4h,交聯(lián)率(±s)分別為1.93±0.45、3.9±1.45、4.2±1.04、6.23±3.22、10.8±0.90、18.6±4.5%。0.05mM甲醛作用2h后引起交聯(lián)率比各短時(shí)間組明顯升高(P<0.01),4h組與2h組差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。0.1mM組作用2h后引起

8、交聯(lián)率明顯升高(P<0.01),但與1.5h組無顯著差異,4h組與各短時(shí)間組有顯著差異(P<0.01)。
　　四、濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mM甲醛作用1.5h,LDH釋放(±s)分別為3.26±3.62、2.01±1.36、2.19±1.10、3.09±1.48、4.59±2.13、5.97±4.16、11.48±2.26%。0.01~1mM組與對(duì)照比無明顯差異(P>0.05),2mM組LDH釋放明顯升

9、高,與0~0.5mM各劑量組比較均有顯著差異(P<0.05)。0.05mM和0.1mM組作用不同時(shí)間LDH釋放量差異無顯著性(P>0.05)。
　　五、0.01mM、0.05mM組作用1.5h在光鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)無明顯改變;≥0.1mM甲醛作用1.5h后,細(xì)胞收縮、變圓、腫脹,細(xì)胞間隙增寬,該變化隨著甲醛濃度增高而更明顯。
　　六、對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲圍繞在細(xì)胞四圍呈條帶狀,排列整齊、分布均勻、粗細(xì)胞勻稱,0.01

10、mM、0.05mM組細(xì)胞骨架無明顯改變,0.1mM組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲排列紊亂,隨著甲醛濃度升高肌動(dòng)蛋白微絲排列紊亂越明顯,2mM組部分細(xì)胞微絲斷裂,收縮呈絮狀。
　　結(jié)論與意義:
　　一、建立并改良了大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)法。
　　二、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞暴露于甲醛下可引起DPC的形成,并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性趨勢(shì)。提示,內(nèi)源性甲醛濃度增高,或生理濃度的內(nèi)源性甲醛長(zhǎng)期作用,可引起 DPC,可能會(huì)導(dǎo)致一些重要基因表達(dá)

11、異常,從而影響細(xì)胞功能或引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而參與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的過程。
　　三、較高濃度甲醛(>0.1mM)可引起內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性增高,并呈劑量依賴性增高。說明甲醛對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
　　四、甲醛作用后細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞收縮、變圓、細(xì)胞間隙增寬。細(xì)胞回縮是血管壁通透性增高的主要機(jī)制,而內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高,有利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　五、較高濃度甲醛(0.1-2mM)作用后,肌動(dòng)蛋白微絲排列紊亂,微