Rac、Cdc42信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的FRET單分子探針的特征分析.pdf

1、Rho鳥苷三磷酸酶(Rho GTPases)，包括Rac和Cdc42，是一類在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域中研究較多的蛋白分子，其主要調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移、細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)等一系列細(xì)胞過程。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Rho GTPases通常作為分子開關(guān)將上游信號刺激傳遞給下游效應(yīng)分子或靶蛋白，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。鳥苷酸交換因子、Rho GTPases活化蛋白和GDP解離抑制因子三類蛋白分子調(diào)節(jié)Rho GTPases的有無活性狀態(tài)。 本文

2、利用本實驗室根據(jù)FRET原理構(gòu)建的包含紅色熒光蛋白DsRed1全基因，信號分子Rac1或Cdc42全基因，效應(yīng)分子Pak1或N-WASP的GTP酶聯(lián)結(jié)區(qū)域，青色熒光蛋白CFP全基因的幾種單分子探針轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞。轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞后，以胰島素、緩激肽為誘導(dǎo)劑，分別激活Rac1、Cdc42信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。離體熒光光譜檢測表明，在轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞中產(chǎn)生了FRET現(xiàn)象。在未誘導(dǎo)激活前，不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的FRET效率已達(dá)相對較高水平。誘導(dǎo)激活5min后，均

3、達(dá)到最高值，但增加幅度有顯著差異。隨著誘導(dǎo)時間的延長，F(xiàn)RET效率下降，但下降速率在不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間有較大差異。蛋白激活試驗證實，誘導(dǎo)激活的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Rac1、Cdc42均處于激活狀態(tài)，其在不同誘導(dǎo)時間的相對激活程度與FRET效率表現(xiàn)一致。誘導(dǎo)激活的Rac1、Cdc42信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞中出現(xiàn)片狀偽足和絲狀偽足。這表明采用這些FRET單分子探針，可直接監(jiān)測細(xì)胞中激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的時空變化及其產(chǎn)生的相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。