青島文昌魚體液補(bǔ)體介導(dǎo)弧菌溶菌活性及弧菌逃避補(bǔ)體攻擊機(jī)制的研究.pdf

1、補(bǔ)體的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化是當(dāng)今免疫學(xué)研究熱點之一。比較免疫學(xué)研究表明脊椎動物和無脊椎動物補(bǔ)體系統(tǒng)有著共同的祖先。在過去10年里，在無脊椎動物后口類、甚至原口類中，結(jié)構(gòu)和功能相似的一些重要補(bǔ)體組分如C3和B因子已經(jīng)得到了鑒定，但有關(guān)這些動物補(bǔ)體功能的研究相當(dāng)有限。文昌魚(Amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，是研究脊椎動物進(jìn)化的珍貴材料。本文選擇了在系統(tǒng)演化上占據(jù)重要地位的文昌魚，對其體液補(bǔ)體介導(dǎo)弧菌溶菌活性進(jìn)行研究，并

2、對弧菌逃避補(bǔ)體攻擊機(jī)制進(jìn)行探討。 本文首次將測定脊椎動物血清補(bǔ)體溶茵活性的標(biāo)準(zhǔn)方法運(yùn)用到文昌魚體液免疫研究中，對文昌魚體液補(bǔ)體的溶菌活性進(jìn)行研究。通過文昌魚體液與弧菌相作用，文昌魚體液能夠在體外抑制溶藻膠弧菌HW284(Vibrio alginolyticus HW284)、副溶血弧菌HW458(Vibrio parahaemolyticus HW458)、哈維氏弧菌SF-1(Vibrio harvey SF-1)的生長，存活

3、率分別為42％，28％和59％。這樣的數(shù)據(jù)在無脊椎動物的后口類尚屬首次。掃描電鏡觀察表明正常文昌魚體液存在溶菌活性，例如，能溶解溶藻膠弧菌HW284，而經(jīng)滅活的體液及無菌過濾海水處理的溶藻膠弧菌HW284表面光滑，細(xì)胞完整。用熱滅活的兔抗人C3血清處理文昌魚體液后，再與溶藻膠弧菌HW284相作用，體液溶菌活性明顯降低，而經(jīng)免疫前的兔血清或PBS處理的體液，溶菌活性不受影響，此外，體液經(jīng)熱處理(45℃，30 min)和反復(fù)凍融處理后，文昌

4、魚體液抑制溶藻膠弧菌HW284生長的活性明顯降低，其存活率分別為89％和81％，而正常體液(對照組)作用后，弧菌的生長不受影響。這些結(jié)果表明補(bǔ)體作用可能是抑制弧菌生長的主要因素。40 mMEGTA(包含4mM MgCl2)處理的文昌魚體液沒有影響溶菌活性，與正常體液(對照組)相比，具有相似的溶菌活性，其存活率分別為42％和44％，在EGTA處理組中添加10mM CaCl2，沒有增強(qiáng)體液的溶菌活性，相反，用40mM EDTA處理文昌魚體液

5、，體液的溶菌活性消失，其存活率為86％，在EDTA處理中添加4 mM MgCl2，恢復(fù)了體液的溶菌活性，這些實驗結(jié)果表明文昌魚體液補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌活性依賴Mg2+，而不依賴Ca2+。另外，用補(bǔ)體替代途徑的選擇性激活劑-酵母聚糖A處理后的文昌魚體液，再與溶藻膠弧菌HW284相作用，體液溶菌活性明顯降低，與未處理的體液相比，在2倍稀釋的體液中，其存活率分別為82％和43％，這些實驗結(jié)果強(qiáng)烈暗示著補(bǔ)體替代途徑的激活與文昌魚體液的溶菌活性相關(guān)。

6、 值得注意的是，7種弧菌中，其中4種弧菌-河弧菌HW293(Vibrio furnissi HW293)、辛辛那提弧菌HW287(Hbrio cincinnatiensis HW287)、鰻弧菌W-1(Vibrio anguillarum W-1)和哈維氏弧菌Z3G2(Vibrio harveyi Z3G2)能夠抵制文昌魚體液補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。本文首次將脊椎動物血清補(bǔ)體消耗標(biāo)準(zhǔn)測定方法運(yùn)用到文昌魚溶菌功能研究中，使用蛋白酶K消

7、化法分別提取辛辛那提弧菌HW287和溶藻膠弧菌HW284的LPS，經(jīng)12％SDS-PAGE電泳、銀染色后，發(fā)現(xiàn)辛辛那提弧菌HW287 LPS既有高分子量的O-抗原又有低分子量的O-抗原的梯狀帶結(jié)構(gòu)，而溶藻膠弧菌HW284幾乎沒有高分子量的O-抗原帶。高分子量的o-抗原缺乏是與溶藻膠弧菌HW284對文昌魚體液敏感相一致的。而辛辛那提弧菌HW287具有許多高分子量的O-抗原呈現(xiàn)出補(bǔ)體抵制，表明O-抗原的大小與體液抵制之間是正相關(guān)的。此外，用