VPAC1受體放射性配體99mTc-TP1724的制備、性質鑒定及其動物體內研究.pdf

1、研究的背景及目的：G蛋白偶聯(lián)受體中有一種被稱為血管活性腸肽受體（VIPR），目前發(fā)現(xiàn)有VPAC1、VPAC2和PAC1三種亞型。研究證實，VPAC1在結直腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤原發(fā)及其轉移灶細胞中高水平表達，而 VPAC2僅表達于良性平滑肌瘤等少數(shù)腫瘤；VPAC1高親和力結合位點（Bmax）是正常組織的22.5～57.9倍。因此，VPAC1是一較為理想的腫瘤分子影像與靶向治療研究靶標，并顯示出潛在的應用前景。然而，目前VIP受體顯

2、像研究探針均為VIP全分子或其類似物，皆能與上述三種受體亞型結合，故缺乏針對VPAC1的高特異性。
　　課題組前期利用噬菌體展示肽庫全細胞差減篩選技術，篩選并鑒定得到高特異靶向VPAC1的線性十二肽（GFRFGALHEYNS，簡稱VP2），其與VPAC1的結合親和力顯著高于天然配體VIP。本研究擬通過多肽化學合成技術合成VP2，同時在其氨基末端偶聯(lián)甘氨酸-丙氨酸(D)-甘氨酸-甘氨酸-氨基丁酸［G(D)AGG-Aba］作為雙功能螯

3、合劑，探討99mTc標記G(D)AGG-Aba-VP2（TP1724）的最佳條件，鑒定99mTc-TP1724的理化性質，研究其示蹤動力學特性、正常動物體內的生物分布和動態(tài)顯像變化特點，奠定以受體VPAC1為靶點腫瘤顯像的基礎。
　　研究方法：
　　1．99mTc-TP1724制備：化學方法合成并制備多肽 TP1724，99mTc的標記（SnCl2作為還原劑），測定標記率（紙層析法），比活度計算（直接法）。
　　2．9

4、9mTc-TP1724多肽理化性質的鑒定：通過穩(wěn)定性實驗（體外）、一步法標記凍干試劑盒實驗、HPLC（高效液相色譜）分析、HSA(人血清蛋白)結合實驗、Cys(半胱氨酸)置換實驗和脂(油)/水分配實驗。
　　3．示蹤動力學的實驗：選取健康的家兔9只，俯臥固定于木質實驗臺上，每只經左側耳緣靜脈注射99mTc-TP1724200μl（37 MBq）；分別在注射1.5min、5min、10min、30min、60min、120min及2

5、40min后從右側耳緣靜脈抽取血液并稱重、測量放射性（cpm）。按血液密度1 g/ml計，經參考源校正，將血樣品放射性換算成kBq/L。用藥代動力學（DAS3.1.6版本）軟件分析，智能化分析平均血液放射性的濃度-時間數(shù)據(jù)，判斷99mTc-TP1724在健康家兔體內的最佳房室模型，并得到其藥-時關系式及示蹤動力學參數(shù)。
　　4．正常大耳兔體內SPECT顯像：Siemens Symbia T6 SPECT/CT，探頭配備常規(guī)準直器（

6、低能高分辨率準直器），能峰為140 KeV，窗寬為20％，矩陣128×128，Zoom（放大系數(shù)）＝1.0。將家兔綁定在實驗木板上（仰臥位），胸腹部對準探頭視野中點。注射99mTc-TP172474MBq（經左側耳緣靜脈)，然后以1幀/sec采集60 sec、1幀/min采集59min；分別于90、120、150、180和240 min經時間衰減校正各預置計時采集1幀。利用ROI技術，作出注射99mTc-TP1724后1h內動態(tài)影像的心

7、、腎、肝、膀胱等組織器官T-A曲線。
　　5．生物分布研究（正常昆明小鼠體內）：35只小鼠分成7組（隨機表法），5只/組。每只注入99mTc-TP1724100ul（3.7 MBq），經尾靜脈注射入體內，分別在以下7個時間點（1.5min時、5min時、10min時、0.5h時、1h時、2h時與4h時）將小鼠立即處死，收集其血、心臟、腎臟、肝臟、腸、肺臟、肌肉（大腿）、大腦和骨（大腿）等組織器官稱重，然后測定其cpm。經參考源校正

8、后，換算為%ID/g。
　　6．大耳兔炎癥模型顯像：取正常大耳兔3只，分別于右后肢內側注射松節(jié)油500μl，常規(guī)飼養(yǎng)7天后形成局部無菌性炎癥。Siemens Symbia T6 SPECT/CT，矩陣256×256，余參數(shù)同4。家兔綁定于實驗木板上（仰臥位），胸腹部對準探頭視野中點。99mTc-TP1724經左耳緣靜脈注射74MBq，并于0.5、2和5h分別預置計時600s、636s、714s、801s、898s、990s采集靜態(tài)

9、圖像1幀。利用ROI技術計算各時相點炎癥灶及其對側正常軟組織放射性的T/NT比值。
　　結果：
　　1．99mTc-TP1724制備：化學方法合成TP1724的純度為97.80%；99mTc-TP1724的標記率為(96.57±0.71)%，其比活度(直接法)為(25.52±0.29)TBq/mmol。
　　2．理化性質鑒定：在室溫下，標記的溶液放置1h、2h、4 h后，99mTc-TP1724的RCP分別為（95.7

10、4±1.53）%、（95.50±2.06）%與（93.64±2.25）%。99mTc-TP1724一步法標記凍干試劑盒4℃保存12周，標記率均穩(wěn)定在90%以上。溫育99mTc-TP1724和正常人的血清，Sephadex G50柱層析結果表明：實驗組的主放射峰形狀與對照組的主放射峰形狀基本上保持一致，保留時間均出現(xiàn)在第42管；實驗組在第16管左右出現(xiàn)小蛋白結合放射峰，約占6.61%。HPLC顯示：TP1724的保留時間和99mTc-TP

11、1724洗脫液RP的時間基本上一致(大約10 min)。半胱氨酸置換實驗顯示，未結合99mTc與對照組相比無明顯增加。標記多肽脂/水分配系數(shù)lg P為－(1.99±0.02)。
　　3．正常大耳兔體內示蹤動力學實驗：家兔血液平均放射性濃度-時間數(shù)據(jù)經 DSA3.1.6軟件智能化分析判定，99mTc-TP1724的示蹤動力學符合權重為1的二室模型；分布半衰期 t1/2α為(2.64±1.32)min，消除半衰期 t1/2β為(78.

12、36±13.38)min，CL(清除率)為(122.15±56.33)ml/min。
　　4．正常大耳兔體內SPECT顯像：心臟、肝臟及雙腎在1 min左右清晰顯影，雙腎和肝臟的影像隨著時間漸漸地減弱；在5 min時大耳兔的膀胱開始顯影，隨著時間顯著增強；0.5h時心臟、軟組織放射性濃聚影大幅度消退，膽囊這時放射性濃聚影出現(xiàn)，腸道出現(xiàn)節(jié)段性很少的放射性分布；胃區(qū)在整個顯像過程中表現(xiàn)為放射性缺損區(qū)，腦部表現(xiàn)為低放射本底影，頸部（包括

13、甲狀腺區(qū)）未見異常放射性濃聚影。
　　5．正常昆明小鼠體內生物分布研究：99mTc-TP1724經小鼠尾靜脈注射后，1h時相的血液放射性比1 min時相下降了98.43%，而腎臟放射性下降82.14%；肝臟放射性10 min時開始下降，在0.5h時腸道的放射性開始增加；心臟、骨及肺臟的放射性快速地減少，大概在1h后與肌肉接近；腦部表現(xiàn)為持續(xù)性、低放射性分布。
　　6．大耳兔炎癥模型顯像：炎癥灶在0.5h左右開始顯影，ROI技

14、術分析0.5h、1h、2h、3h、4h和5 h的炎癥側/對照側（T/NT）的放射性比值分別為2.19±0.12、2.17±0.11、2.05±0.13、2.02±0.15、1.96±0.19與1.68±0.21。
　　結論：
　　1．本課題研究制備99mTc-TP1724的方法簡單、易操作，保證標記率＞95%（間接法標記），不需要分離純化，可以直接應用；易于制備一步法標記凍干試劑盒，便于臨床推廣應用；
　　2．標記率和