低強(qiáng)度超聲對(duì)體外骨關(guān)節(jié)炎狀態(tài)下的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是探究低強(qiáng)度超聲作用于體外白介素1β因子刺激下大鼠顳下頜軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化，以及LIPUS對(duì)顳下頜軟骨細(xì)胞的骨保護(hù)作用。
　　方法:
　　取4周齡Wistar大鼠髁突軟骨細(xì)胞，于體外培養(yǎng)。在無菌的條件下，取雙側(cè)髁突組織，用含有雙抗的PBS，沖洗、剝離髁突軟骨，反復(fù)剪切至1mm3大小，首先在37℃環(huán)境下用0.25％濃度的胰蛋白酶消化30分鐘，然后37℃振蕩加入濃度為

2、0.2％的Ⅱ型膠原酶，1-2小時(shí)消化完后、分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng)，原代軟骨細(xì)胞生長、形態(tài)變化，通過每天用倒置光學(xué)顯微鏡觀測(cè)，并用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色方法，來鑒定培養(yǎng)結(jié)果。隨機(jī)將髁突軟骨細(xì)胞第二代分為四組，分別用0、1、5、10ng/ml IL-1β處理48小時(shí)，對(duì)各組之間Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG蛋白和mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并篩選出能造成

3、髁突軟骨細(xì)胞炎性狀態(tài)的IL-1β最佳濃度和檢測(cè)IL-1β改變對(duì)于Wnt/β-catenin通路的不同影響;取已鑒定的髁突軟骨細(xì)胞P2隨機(jī)分為五組:對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理;IL-1β組，10ng/ml IL-1β處理48小時(shí);LIPUS組，10ng/ml IL-1β處理48小時(shí)后LIPUS每天處理20分鐘，共七天?？瞻踪|(zhì)粒+LIPUS組:10ng/ml IL-1β處理48小時(shí)，提前48小時(shí)加入空載質(zhì)粒后LIPUS每天處理20分鐘，共七天

4、。siRNA+LIPUS組:10ng/ml IL-1β處理48小時(shí)，提前48小時(shí)加入DKK1干擾質(zhì)粒siRNA后LIPUS每天處理20分鐘，共七天。分別用western blotting檢測(cè)各組之間Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG的蛋白表達(dá)量;qRT-PCR檢測(cè)各組Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG mRNA表達(dá)量;倒置熒光顯微鏡觀

5、測(cè)siRNA對(duì)于軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:
　　(1)消化髁突，提取軟骨細(xì)胞接種，觀察見細(xì)胞呈形態(tài)規(guī)則、小圓形。一天后，細(xì)胞多數(shù)貼壁，鏡下觀察可呈多邊形或者星形;5天后，可觀察到“鋪路石”樣。經(jīng)一次傳代后，細(xì)胞貼壁的速度明顯變快，勻稱分布;據(jù)我們觀察在4代以內(nèi)，軟骨細(xì)胞增殖速率較快。在此以后，髁突軟骨細(xì)胞呈長梭形，出現(xiàn)“去極化”現(xiàn)象，生長速度加快。胞漿內(nèi)可見有棕黃色顆粒和紅色熒光顆粒，通過Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫

6、熒光染色發(fā)現(xiàn)。(2)10ng/ml IL-1β降低髁突軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和AGG表達(dá)的效果最明顯，對(duì)于Wnt/β-catenin通路有顯著促進(jìn)作用，同時(shí)DKK1表達(dá)升高。(3)低強(qiáng)度超聲干預(yù)炎性髁突軟骨細(xì)胞后，collagenⅡ、AGG表達(dá)水平明顯升高，Wnt3a、β-catenin、GSK3β下降，DKK1表達(dá)升高;低強(qiáng)度超聲干預(yù)并加入DKK1干擾RNA后，DKK1，collagenⅡ、AGG表達(dá)水平下降，Wnt3a、β-catenin