人來(lái)源和蝙蝠來(lái)源乙腦病毒株感染果蝠的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　果蝠以水果為食，體型較大，易于飼養(yǎng)，與人類和蚊子關(guān)系密切，且曾有研究表明果蝠可通過(guò)人工注射途徑而實(shí)驗(yàn)感染乙腦病毒。因此，為探討人來(lái)源及蝙蝠來(lái)源乙腦病毒株對(duì)蝙蝠的感染性是否存在差異，我們選擇果蝠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。
　　方法：
　　1.蝙蝠的捕獲與處理
　　分別于2013年6月和2014年6月，在廣東和海南省部分地區(qū)捕獲果蝠，捕獲蝙蝠的地點(diǎn)主要為廢日房屋和公園棕櫚樹。懷孕和哺乳期的蝙蝠放生，其余的

2、果蝠則帶回實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)。每天喂養(yǎng)新鮮的水果（香蕉、番石榴、蘋果和梨子等）。
　　2.病毒株
　　在實(shí)驗(yàn)中使用了1株人來(lái)源的乙腦病毒株(NAK)和2株蝙蝠來(lái)源的乙腦病毒株（HN2和GD1）。NAK病毒株為乙腦病毒原型株，于1935年從一個(gè)日本乙腦死亡病人腦組織中分離到，HN2病毒株于2008年分離自海南地區(qū)的長(zhǎng)翼蝠，GD1病毒株于2009年分離自廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠。3株乙腦病毒在注射果蝠之前均通過(guò)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒

3、擴(kuò)增，并分別計(jì)算其擴(kuò)增后病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose，TC ID50)。
　　3.蝙蝠感染乙腦病毒
　　研究中包括了2個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一有8只果蝠，隨機(jī)分成3組(NAK1，HN2-1和GD1-1組)，其中NAK1組有3只果蝠（bat1，bat2和bat3），HN2-1組3只果蝠(bat4，bat5和bat6)，GD1-1組2只果蝠（bat7和bat8）。三組果蝠分別在大

4、腿根部采取皮下注射的方法注射0.1 ml NAK(104.23 BHK-21 TCID50/0.1ml)、HN2(105.24 BHK-21TCID50/0.1 ml)和GD1(105.86 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。
　　實(shí)驗(yàn)二有11只果蝠，也隨機(jī)分成3組（NAK2，GD1-2和NEG組），其中NAK2組4只果蝠（bat9，bat10，bat11和bat12）、GD1-2組5只果蝠(bat13、bat14

5、、bat15、bat16和bat17)。這兩組果蝠分別皮下注射0.1 ml NAK(103.50 BHK-21TCID50/0.1 ml)和GD1(103.00 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。NEG組在實(shí)驗(yàn)中作為陰性對(duì)照，包括2只果蝠（bat18和bat19），大腿根部皮下注射0.1 ml不含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液。
　　注射乙腦病毒前后，每天觀察實(shí)驗(yàn)果蝠的臨床表現(xiàn)并記錄。采用割大腿的方式分別獲取果蝠注射乙腦病毒前0

6、天以及注射乙腦病毒后4天、14天、21天的血液。所有果蝠在注射乙腦病毒后21天處死，無(wú)菌解剖觀察果蝠內(nèi)臟變化情況，并取腦組織標(biāo)本，保存在含有RNAlater的凍存管中，放入-80℃保存，待檢。
　　4.蝙蝠乙腦病毒的檢測(cè)
　　單層BHK-21細(xì)胞接種所有實(shí)驗(yàn)果蝠的血清樣本，細(xì)胞染毒血清后，觀察細(xì)胞病變時(shí)間≤7天。采用Roche High Pure viral RNA kit提取蝙蝠腦組織及血清病變細(xì)胞液的病毒RNA，用Roc

7、he Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用TaqMan Real time RT-PCR法檢測(cè)腦組織和血清中的乙腦病毒。
　　5.蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測(cè)
　　采用間接ELISA和病毒中和試驗(yàn)兩種方法對(duì)果蝠體內(nèi)的乙腦病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。若ELISA IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性，則進(jìn)一步進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)觀察果蝠乙腦病毒中和抗體產(chǎn)生情

8、況。間接ELISA方法是在商售JEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立的蝙蝠JEV IgG抗體檢測(cè)方法，也就是將購(gòu)白武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司的豬JEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)二抗，更換為購(gòu)自美國(guó)Thermo公司的Recombinant Protein A/G，Peroxidase Conjugated。病毒中和試驗(yàn)則主要參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS214-2008)操作步驟進(jìn)行。
　　6.病理學(xué)檢

9、查
　　將實(shí)驗(yàn)果蝠腦組織樣本制成病理切片，顯微鏡下觀察果蝠腦組織病理變化情況。
　　7.質(zhì)量控制
　　1)移液槍頭、凍存管、EP管等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品;
　　2) RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和配制試劑如移液槍頭、EP管等，均事先用DEPC水處理，且仔細(xì)操作，防止環(huán)境中RNA酶的污染;
　　3)細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作均在細(xì)胞培養(yǎng)間的超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，防止污染;
　　4)果蝠的解剖在無(wú)菌間生物安全柜進(jìn)行，

10、全程做好個(gè)人防護(hù)工作;
　　5)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照;
　　6)果蝠的血清采集和保存過(guò)程嚴(yán)防細(xì)菌污染。
　　結(jié)果：
　　1.蝙蝠臨床表現(xiàn)
　　實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二中的果蝠在注射乙腦病毒前后均未出現(xiàn)任何典型的乙腦臨床癥狀，身上也無(wú)任何受傷的痕跡，毛色正常。果蝠進(jìn)食狀況良好，無(wú)異常表現(xiàn)。在無(wú)菌解剖時(shí)，果蝠內(nèi)臟有輕微缺血表現(xiàn)。
　　2.蝙蝠病毒血癥檢測(cè)結(jié)果
　　所有的果蝠血清樣本均通過(guò)BH

11、K-21細(xì)胞進(jìn)行了病毒增值。在實(shí)驗(yàn)一中，細(xì)胞可見到明顯的病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），主要有細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增寬以及細(xì)胞脫落等。實(shí)驗(yàn)一中的大多血清樣本(7/13)通過(guò)TaqMan Real timeRT-PCR檢測(cè)乙腦病毒陽(yáng)性，且三個(gè)注射組間檢出率相似。實(shí)驗(yàn)二中的所有果蝠均未檢測(cè)到病毒血癥。
　　3.蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測(cè)結(jié)果
　　利用TaqMan Real time RT-PCR法對(duì)實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)

12、二中果蝠腦組織標(biāo)本進(jìn)行乙腦病毒檢測(cè)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)一f中所有果蝠腦組織標(biāo)本（除了HN2-1組的bat5）均乙腦病毒檢測(cè)陽(yáng)性，而實(shí)驗(yàn)二中所有果蝠腦組織標(biāo)本均為陰性。
　　4.蝙蝠ELISA檢測(cè)結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二的所有注射病毒的果蝠血清均檢測(cè)到了抗乙腦病毒IgG抗體，提示果蝠對(duì)來(lái)自人型和蝙蝠型的乙腦病毒株都可產(chǎn)生免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)一的果蝠在感染乙腦病毒第4天時(shí)乙腦病毒IgG抗體陰性，后全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性;實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二的果蝠均在感染乙腦病

13、毒第14～21天左右產(chǎn)生乙腦病毒抗體高峰。
　　5.蝙蝠乙腦病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果
　　對(duì)所有感染乙腦病毒的實(shí)驗(yàn)果蝠的21天血液進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，結(jié)果15個(gè)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中有14個(gè)病毒中和試驗(yàn)陽(yáng)性（陽(yáng)性率93.3％），只有GD1-2組的bat14為陰性。實(shí)驗(yàn)一的中和抗體滴度均高于實(shí)驗(yàn)二的中和抗體滴度(1∶23.41～1∶56.30vs.1∶5.00～1∶15.87，t=-5.733,P＜0.001)。
　　6.

14、蝙蝠腦組織病理檢查結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)二中NAK2和GD1-2組的果蝠腦組織均大體結(jié)構(gòu)正常，但可見輕微的炎癥反應(yīng)，包括輕度的血管充血、水腫、淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)等。實(shí)驗(yàn)一果蝠腦組織未進(jìn)行病理學(xué)檢查。
　　結(jié)論：
　　1、果蝠對(duì)人來(lái)源(NAK)及蝙蝠來(lái)源（HN2和GD1）的乙腦病毒株均易感，且均為無(wú)癥狀感染，提示乙腦病毒已經(jīng)適應(yīng)果蝠。
　　2、人來(lái)源(NAK)和蝙蝠來(lái)源（HN2和GD1）乙腦病毒株對(duì)果蝠的感染力、毒力相似，且果蝠