siRNA沉默X-盒結(jié)合蛋白1對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響.pdf

1、急性胰腺炎（AP）是臨床常見的危重疾病，起病急驟，病情發(fā)展迅速，病死率較高。除了胰腺本身病變外，還可以引起胰腺外組織和器官的損傷，甚至誘發(fā)全身炎癥反應綜合癥和多器官功能障礙綜合征而導致死亡。盡管在過去的幾十年里急性胰腺炎的研究取得明顯進展，但是其發(fā)病機制仍較復雜。隨著近幾年來細胞分子生物學等方面的深入研究，胰腺腺泡細胞損傷的細胞生物學機制取得較大進展，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）引起廣泛關(guān)注。X-盒結(jié)合蛋白1（XBP1）是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折

2、疊有關(guān)的蛋白質(zhì)。XBP1在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應及維持成熟腺泡細胞生存力中起到直接重要作用，其表達上調(diào)常用于ERS的標志。大量研究已表明XBP1與糖尿病、腫瘤、炎癥性疾病、病毒感染、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但是目前XBP1與胰腺炎關(guān)系的研究較少，故本研究擬初步探討siRNA沉默XBP1對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響。
　　目的：通過雨蛙素或雨蛙素聯(lián)合脂多糖作用于沉默XBP1基因的

3、AR42J細胞獲得不同程度的胰腺炎模型。并通過監(jiān)測細胞培養(yǎng)液中淀粉酶（amylase,AMY）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的水平，初步探討 siRNA沉默 XBP1對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響。
　　方法：⑴獲得XBP1基因沉默的AR42J細胞：用熒光標記的 siRNA（FAM-siRNA）轉(zhuǎn)染細胞，通過熒

4、光顯微鏡篩選出siRNA轉(zhuǎn)染的最適濃度。在與XBP1沉默相關(guān)的三條siRNA中，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）篩選出沉默效果最佳的siRNA。⑵制造模型：將AR42J細胞隨機分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組：用沉默效果最佳的siRNA轉(zhuǎn)染AR42J細胞，后將細胞分為三組：雨蛙素組（CAE組）、雨蛙素+脂多糖組（CAE+LPS組）、對照組（Control組）

5、。CAE組給予10-7 mol/L雨蛙素，CAE+LPS組組給予10-7 mol/L雨蛙素+10 mg/L脂多糖，Control組給予等體積完全培養(yǎng)基。分別于4h、8h、24h三個時間點收集各組細胞上清液。未轉(zhuǎn)染組：將未轉(zhuǎn)染的 AR42J細胞分為三組：CAE組、CAE+LPS組、Control組。干預方法同上。⑶采用RT- PCR觀察AR42J細胞中轉(zhuǎn)染效果。應用淀粉酶試劑盒檢測細胞上清中淀粉酶（ amylase,AMY）水平，利用 E

6、LISA（enzyme linked immunosorbent assay）方法檢測細胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α（ tumor necrosis factor-α,TNF-α）及白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）水平。⑷應用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：①用不同siRNA轉(zhuǎn)染細胞，為篩選沉默效果最佳的siRNA行熒光定量PCR檢測XBP1 mRNA表達，結(jié)

7、果顯示：XBP1-303組、XBP1-684組、XBP1-808組與空白組比較XBP1 mRNA表達水平較低，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，其中XBP1-303組XBP1 mRNA表達水平顯著下降。陰性對照組、Lipo組與空白組比較XBP1 mRNA表達水平間無統(tǒng)計學差異。②細胞培養(yǎng)上清AMY：未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較：在各時間點，Control組細胞上清AMY水平較低且無顯著變化；與之相比，CAE組及CAE+LPS組AMY水平均顯

8、著升高(P＜0.05)，且隨時間延長而逐漸上升在8 h達最高水平；與CAE組相比，CAE+LPS組各時間點血清AMY水平則明顯上升(P＜0.05)。兩組組間比較：除Control組各時間點AMY水平無統(tǒng)計學差異外，CAE組及CAE+LPS組各時間點AMY水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(P＜0.05)。③細胞培養(yǎng)上清TNF-α：未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較：Control組細胞上清TNF-α水平在各時間點均較低；CAE組及CAE+LPS組

9、分別與Control組比較，各時間點TNF-α均顯著升高(P＜0.05)，且隨時間延長而逐漸上升；CAE+LPS組與CAE組相比，在各時間點血清TNF-α水平均明顯上升(P＜0.05)。兩組組間比較：在各時間點，Control組TNF-α水平無統(tǒng)計學學差異，CAE組及CAE+LPS組TNF-α水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(P＜0.05)。④細胞培養(yǎng)上清IL-6：未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較：在各時間點， Control組細胞上清IL-

10、6水平均無顯著變化，且較低；CAE組及CAE+LPS組各時間點IL-6水平均隨時間延長而逐漸上升，且較Control組顯著升高(P＜0.05)；在各時間點與CAE組相比，CAE+LPS組細胞培養(yǎng)上清IL-6水平均明顯上升(P＜0.05)。兩組組間比較：Control組各時間點IL-6水平無顯著變化，CAE組及CAE+LPS組各時間點IL-6水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴應用雨蛙素及雨蛙素聯(lián)合脂多糖可