藍(lán)細(xì)菌基因組比較分析：異形胞發(fā)育進(jìn)化及3’，5’-二磷酸核苷酸酶HalA的功能研究.pdf

1、藍(lán)細(xì)菌是地球上最為古老的物種之一。一些絲狀藍(lán)細(xì)菌在缺氮環(huán)境中，菌絲體上有部分細(xì)胞會(huì)分化成專門(mén)執(zhí)行固氮功能的異形胞(heterocyst)。化石證據(jù)和地質(zhì)學(xué)證據(jù)表明，異形胞大約出現(xiàn)在24億年前，是地球上已知的最早出現(xiàn)的細(xì)胞分化現(xiàn)象之一。 異形胞形成機(jī)制是藍(lán)細(xì)菌研究的重要領(lǐng)域。最近二十多年來(lái)，發(fā)現(xiàn)了近百個(gè)與異形胞發(fā)育密切相關(guān)的基因(如氮代謝過(guò)程中的全局調(diào)控基因ntcA，異形胞分化中心調(diào)控基因hetR，固氮酶基因nifHDK，異形胞胞

2、被合成基因hepA、hglE等)和一些小分子信號(hào)(如2-OG、Ca2+等)。這些基因和信號(hào)分子構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的異形胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在進(jìn)化中是如何形成的卻仍不清楚，與此相關(guān)的研究也還處于空白。 在本論文中，我們用比較基因組學(xué)的方法研究了異形胞發(fā)育的進(jìn)化過(guò)程。我們檢測(cè)了產(chǎn)異形胞藍(lán)細(xì)菌AnabaenaPCC7120中已知的異形胞發(fā)育相關(guān)基因(het基因)在其他18種藍(lán)細(xì)菌基因組中的分布，發(fā)現(xiàn)大部分的het基因還存在于其它

3、不產(chǎn)異形胞菌株的基因組中。根據(jù)分布情況，her基因可分為以下幾類：一，在多數(shù)藍(lán)細(xì)菌中都存在的基因；二，只在絲狀菌株中存在的基因；三，只在固氮菌株中存在的基因；四，主要在產(chǎn)異形胞菌株中存在的基因；五，其他分布類型的基因。利用分布情況和序列信息，我們分析了每個(gè)het基因的進(jìn)化過(guò)程。結(jié)果表明，一，het基因出現(xiàn)在藍(lán)細(xì)菌進(jìn)化的各個(gè)階段；二，絕大部分的het基因在異形胞分化現(xiàn)象出現(xiàn)之前就已經(jīng)存在于藍(lán)細(xì)菌基因中了；三，水平基因轉(zhuǎn)移在異形胞進(jìn)化過(guò)程中

4、發(fā)揮了重要作用。 在AnabaenaPCC7120中，HetR和PatS共同調(diào)控了異形胞分化起始以及其在菌絲上的分布。我們?cè)诒粰z測(cè)的幾種不產(chǎn)異形胞的絲狀藍(lán)細(xì)菌中皆發(fā)現(xiàn)了HetR的表達(dá)，并在已知基因組序列的幾種絲狀藍(lán)細(xì)菌(包括不產(chǎn)異形胞菌株TrichodesmiumIMS101和Arthrospiraplatensis的基因組)中皆發(fā)現(xiàn)了patS基因。Arthrospiraplatensis細(xì)胞內(nèi)的HetR蛋白在缺氮后表達(dá)增加。在

5、AnabaenaPCC7120中Arthrospiraplatensis的hetR基因(arhetR)會(huì)刺激異形胞分化，而Arthrospiraplatensis的patS基因(arpatS)會(huì)抑制異形胞分化，并且它們也分別受到與Anabaena自身hetR和patS類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此結(jié)果表明，hetR和patS基因在產(chǎn)異形胞藍(lán)細(xì)菌和不產(chǎn)異形胞藍(lán)細(xì)菌的共同祖先基因組中就已存在了，并且那時(shí)它們就已形成了相互作用的方式。 基于上述的

6、生物信息分析和實(shí)驗(yàn)工作，我們推測(cè)了異形胞發(fā)育的進(jìn)化過(guò)程。在異形胞出現(xiàn)之前，許多重要的異形胞發(fā)育調(diào)控因子之間就已經(jīng)形成了一個(gè)基本氮利用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，異形胞的進(jìn)化實(shí)質(zhì)上就是一個(gè)不斷獲取必需的her基因，并將其納入該網(wǎng)絡(luò)中的過(guò)程。從根本上說(shuō)，異形胞的產(chǎn)生是藍(lán)細(xì)菌為了更好利用氮源而不斷適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。本研究結(jié)果將有助于了解生物界最初的演化過(guò)程，也可以為研究高等生物的細(xì)胞分化提供啟示。 我們?cè)诼菪{(lán)細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為957bbp的基因，

7、其編碼序列與酵母和植物中的3’，5’-二磷酸腺苷-5’-磷酸酶(PAPase)很相似，該基因被命名為halA。PAPase是硫同化途徑中必需的一個(gè)酶，它負(fù)責(zé)將硫同化過(guò)程中產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物3’，5’-二磷酸腺苷-5’-磷酸(PAP)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒性的AMP。在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)PAPase，它們對(duì)Li+/Na+都非常敏感，極低濃度的Li+/Na+就可使其失去活性，從而引起細(xì)胞內(nèi)PAP的積累，最終產(chǎn)生細(xì)胞毒性。作為細(xì)胞內(nèi)對(duì)鹽離子最敏感的酶

8、之一，PAPase的耐鹽能力往往決定了細(xì)胞的耐鹽能力。 我們將halA基因在F.coli中進(jìn)行了克隆、表達(dá)和生化性質(zhì)研究。酶活測(cè)定表明HalA是一種Mg2+依賴型的PAPase，它對(duì)PAP和3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate(PAPS)皆具有特異性的降解活性。比起大多數(shù)的PAPase，HalA對(duì)Li+和Na+具有優(yōu)良的耐受性(Li+和Na+對(duì)HalA活性的50％抑制濃度[IC50]分別為3

9、.6mmol/L和600mmol/L)。 結(jié)構(gòu)分析顯示，HalA與Ha12p蛋白在底物結(jié)合位點(diǎn)存在一定差異，此差異很可能使得HalA蛋白表現(xiàn)出更好的Li+/Na+耐受性，并對(duì)PAP具有較弱的結(jié)合力。表達(dá)了HalA的大腸桿菌在含高濃度Li+的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況明顯比對(duì)照好，意味著原核生物中PAPase可能同樣是鹽離子毒性的靶點(diǎn)。由于HalA是已知對(duì)Na+具有最不敏感的PAPase，因此在其他生物中表達(dá)HalA將可能是有效提高生物耐鹽