六株細(xì)腳擬青霉原生質(zhì)體制備和染色體核型研究.pdf

1、本文對(duì)5株來自不同產(chǎn)地的細(xì)腳擬青霉的產(chǎn)孢條件、最佳酶解條件、原生質(zhì)體制備工藝和6株菌株脈沖電泳條件進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下。
　　 不同的菌株在不同的培養(yǎng)基、不同溫度下培養(yǎng)2周后，產(chǎn)孢量和菌絲生長量都有顯著差異，最佳產(chǎn)孢光照時(shí)間也各不相同，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為：pt165在查氏培養(yǎng)基上，27℃中黑暗培養(yǎng)產(chǎn)孢最好：pt173的產(chǎn)孢量和菌絲量的最佳條件可選取在PDA上，29℃光照2d產(chǎn)孢；pt208在查氏上，23℃光照培養(yǎng)6d產(chǎn)孢最好；pt

2、223在查氏上，23℃光照培養(yǎng)6d產(chǎn)孢最好；pt45在PDA上，27℃下較長時(shí)間的光照產(chǎn)孢較好。
　　 菌絲獲取方法的不同會(huì)對(duì)菌絲酶解效果產(chǎn)生很大的影響，結(jié)果表明：選取液體種子轉(zhuǎn)接入新鮮的培養(yǎng)基中，萌發(fā)一段時(shí)間后搖瓶中的菌絲生長階段不一致，造成同樣酶解時(shí)間下原生質(zhì)體量的不同，使后續(xù)的實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行。取長勢一致的孢子懸浮液接入液體搖瓶中，孢子萌發(fā)情況一致，酶解效果很好，且實(shí)驗(yàn)也容易定量控制。
　　 不同的菌株孢子萌發(fā)時(shí)間也對(duì)

3、酶解效果產(chǎn)生很大影響，孢子濃度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：pt165在孢子濃度為107個(gè)/ml濃度時(shí)，菌絲萌發(fā)的時(shí)間比孢子濃度為108個(gè)/ml以上時(shí)菌絲萌發(fā)時(shí)間短，酶解效果也比孢子濃度大的酶解效果好，其他菌株結(jié)果也一致。
　　 不同的菌株由于各自細(xì)胞壁的成分有或多或少的差別，所以酶解的最佳酶解體系和最佳濃度也有差別。pt165在2％蝸牛酶+2％纖維素酶的組合下酶解4h效果最好，可以達(dá)到15.04×106個(gè)/ml以上；pt173和pt45在該

4、組合濃度下的酶解效果也很好，酶解時(shí)間分別為3.5h、4h后產(chǎn)生原生質(zhì)體量分別可以達(dá)到15.6×106個(gè)/ml，25.88×106個(gè)/ml； pt208在2％蝸牛酶+2％溶壁酶組合下酶解3.5h效果最好，最后結(jié)果可以達(dá)到15.12×106個(gè)/ml； pt223在該組合濃度下酶解3.5h效果也很好，可以達(dá)到9.23×106個(gè)/ml。
　　 菌株在不同酶解體系下，酶解獲得原生質(zhì)體量的最佳時(shí)間也不一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，纖維素酶的作用效果要緩慢

5、一些，同樣酶解條件下，如果有纖維素酶的參與，酶解的最佳時(shí)間會(huì)稍微偏長一些，但是產(chǎn)生的原生質(zhì)體量會(huì)最終超過其他酶解體系，所以可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的酶解體系，本實(shí)驗(yàn)是選擇酶解時(shí)間較短的最佳酶解體系和濃度。
　　 不同的酶解溫度也會(huì)對(duì)酶解效果產(chǎn)生很大的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇的幾個(gè)溫度梯度下篩選的結(jié)果為：pt165，pt208和pt223都在37℃酶解效果最好，溫度升高或降低酶解效果都降低；pt45和pt173都在29℃時(shí)酶解效果最

6、好。
　　 電泳條件篩選過程中，電泳總時(shí)間、脈沖時(shí)間、電壓和角度，及緩沖液均對(duì)電泳結(jié)果產(chǎn)生影響。不同的菌株具有長度多態(tài)性，染色體條帶的分子量有差別，電泳條件也會(huì)有很大變化，經(jīng)過多次篩選所得結(jié)果為：電泳的第1階段總時(shí)間為48h，溫度為14℃，電泳液為1×TAE，0.8％的膠，電壓為2v/cm，脈沖時(shí)間為20～30min，轉(zhuǎn)換角度為1060；第2階段總時(shí)間為16h，溫度為14℃，電泳液為1×TAE，0.8％的膠，電壓為3 v/cm，

7、脈沖時(shí)間為500s，轉(zhuǎn)換角度為106°。
　　 經(jīng)過對(duì)篩選條件后得到的條帶分析發(fā)現(xiàn)：不同菌株染色體數(shù)目和長度多態(tài)性很明顯，詳細(xì)結(jié)果為pt173，pt223有5條或者5條以上的染色體條帶，pt45有6條或者6條以上的條帶，pt97和pt208至少有7條大小不同的染色體條帶，以Mb為單位，其大小分別為：pt165跑出來的條帶約為5.56、3.77、3.11、2.87、2.44、0.31，估計(jì)核型大小至少約為18.06Mb； pt97

8、條帶大小約為5.78、4.70、3.94、3.28、2.88、2.45、0.43，其中上往下數(shù)第2條條帶異常明亮，估計(jì)是的2條或者2條以上的條帶重合所致，所以其核型大小至少約為25.91Mb； pt223條帶大小約為5.75、3.05、2.90、2.80、2.29，估計(jì)核型大小約為16.79Mb； Pt208條帶大小約為5.37、4.49、3.50、2.99、2.72、2.46、0.44，估計(jì)核型大小約為21.97Mb； pt173電泳