甲基烯丙基二硫醚對(duì)炎癥性腸病的治療作用機(jī)制及固體制劑的初步研究.pdf

1、本課題所評(píng)價(jià)的具有治療炎癥性腸病的活性化合物甲基烯丙基二硫醚（AMDS）來自大蒜。大蒜不僅具有殺菌、抗菌的作用，同時(shí)流行病學(xué)研究表明，大蒜中一些硫化物能夠降低癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病也具有一定的作用。此外也有研究發(fā)現(xiàn)其中一些硫化物還具有保肝和抗炎的作用。大蒜的許多藥理作用得益于其中的硫化物，不同的硫化物具有不同的藥理作用，目前，大蒜中的一些硫化物（如大蒜素）已經(jīng)成功開發(fā)為藥物制劑。AMDS是大蒜眾多有機(jī)硫化物中的一種，但是關(guān)于AMD

2、S對(duì)炎癥性腸病治療的藥理活性以及制劑開發(fā)方面的研究均未見報(bào)道。因此本課題首次對(duì)AMDS用于炎癥性腸病的初步治療以及固體制劑制備進(jìn)行研究，以期為AMDS用于腸道疾病的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
　　本課題的內(nèi)容包括四個(gè)方面。第一， AMDS的藥理活性評(píng)價(jià)，主要考察AMDS對(duì)于炎癥性腸病的治療作用和作用機(jī)制以及對(duì)藥物引起的急性肝損傷的保護(hù)作用;第二，AMDS的基本性質(zhì)評(píng)價(jià);第三，AMDS的固化工藝和腸溶制劑進(jìn)行初步研究，通過不同固體

3、化工藝制備AMDS三種固體劑型，進(jìn)一步制備腸溶制劑并對(duì)其評(píng)價(jià);第四， AMDS制劑生物藥劑學(xué)的初步研究，對(duì)主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，并對(duì)AMDS制劑的的代謝產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)過程進(jìn)行了研究。
　　AMDS用于腸炎治療的初步體外作用及機(jī)制研究涵蓋HT-29和Caco-2體外細(xì)胞模型的構(gòu)建，細(xì)胞因子IL-8和IP-10的抑制作用評(píng)價(jià)以及NF-κB信號(hào)通路研究。采用SRB法和測(cè)定細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)水平兩種方式考察AMDS對(duì)于細(xì)胞活

4、性的影響;用ELISA實(shí)驗(yàn)考察TNF-α對(duì)兩種細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)IL-8和IP-10分泌量的影響，同時(shí)考察AMDS對(duì)于兩種細(xì)胞分泌的IL-8和IP-10影響;采用RT-PCR方法考察AMDS對(duì)于TNF-α的誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IL-8 mRNA水平影響，采用Western blotting方法考察AMDS對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)情況以及用免疫熒光方法考察NF-κB-p65轉(zhuǎn)移情況。SRB法和LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在0～150μM的濃

5、度范圍內(nèi)，AMDS對(duì)于細(xì)胞增殖活性沒有影響;而TNF-α對(duì)兩種細(xì)胞IL-8和IP-10影響測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)兩種細(xì)胞因子分泌量越來越多，具有時(shí)間依賴性，24h達(dá)到最大，表明TNF-α能夠誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子。AMDS對(duì)TNF-α誘導(dǎo)兩種不同細(xì)胞中分泌的IL-8和IP-10作用結(jié)果表明，采用不同的濃度AMDS預(yù)孵育細(xì)胞3小時(shí)能顯著降低因TNF-α誘導(dǎo)升高的IL-8和IP-10水平，且具有濃度依賴性。AMDS對(duì)于TNF-

6、α的誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IL-8 mRNA水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AMDS能顯著的抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8的mRNA的積累，而對(duì)管家基因GAPDH的mRNA水平?jīng)]有影響。Western blotting以及免疫熒光的結(jié)果表明，AMDS能抑制NF-κB中的κ3α蛋白的降解及NF-κBp65蛋白的轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果表明AMDS可以抑制結(jié)腸細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌，抗炎作用調(diào)節(jié)途徑有一部分可能是通過NF-κB信號(hào)通路完成的。
　　AMDS用

7、于腸炎治療的作用及機(jī)制的體內(nèi)初步研究包括大鼠腸炎模型的構(gòu)建、細(xì)胞因子和抗氧化酶的評(píng)價(jià)以及NF-κB信號(hào)通路研究。采用三硝基苯磺酸(TNBS)構(gòu)建腸炎大鼠模型，考察大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-8及IL-10變化，同時(shí)測(cè)定結(jié)腸中的生化指標(biāo)髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)，采用病理組織切片觀察結(jié)腸病變情況，免疫組化方法考察結(jié)腸中NF-κB的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TN

8、BS模型組的大鼠血清中TNF-α、IL-8顯著升高，IL-10則顯著降低。AMDS預(yù)防組和治療組與模型組比較，TNF-α及IL-8水平均顯著下降，而IL-10水平升高。結(jié)腸中生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明AMDS對(duì)于結(jié)腸中的MPO、SOD、MDA及GSH-PX具有調(diào)節(jié)作用。AMDS能夠抑制TNBS造成的MDA和MPO水平的升高，同時(shí)TNBS造模后降低的SOD及GSH-PX的活性經(jīng)過AMDS治療后也能升高。HE染色觀察以及免疫組化的結(jié)果表明TNBS

9、造成了大鼠結(jié)腸的炎癥和損傷，而AMDS對(duì)炎癥具有抑制作用，同時(shí)能修復(fù)損傷的結(jié)腸組織。同時(shí)免疫組化的結(jié)果也表明AMDS對(duì)于腸炎的治療作用一部分機(jī)制可能是通過NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，該結(jié)果和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　AMDS保肝作用的初步體內(nèi)研究由小鼠藥物肝損傷模型的構(gòu)建，常規(guī)肝損傷指標(biāo)的評(píng)價(jià)以及保肝作用機(jī)制研究等部分組成。本文采用對(duì)乙酰氨基酚(APAP)構(gòu)建急性肝損傷模型，考察了AMDS對(duì)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草

10、轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、TNF-α和IL-6活性的影響;同時(shí)考察AMDS對(duì)肝組織中的MDA、SOD、谷胱甘肽(GSH)、GSH-PX和GSH/GSSG的水平，用組織病理切片考察肝損傷情況，用免疫組化法(IHC)觀察肝細(xì)胞的炎癥和脂質(zhì)過氧化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇400mg/kg的劑量構(gòu)建了APAP急性肝損傷模型，AMDS顯著的抑制了血清中ALT、AST、LDH、TNF-α和IL-6活性升高;同時(shí)抑制了肝組織中MDA的升高和G

11、SH及SOD、GSH-PX和GSH/GSSG的降低，減少了肝損傷。肝組織病理切片及免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AMDS具有較好的肝保護(hù)能力。
　　AMDS的基本性質(zhì)評(píng)價(jià)包括結(jié)構(gòu)確證、體外含量分析方法的建立，溶解度、油水分配系數(shù)測(cè)定及穩(wěn)定性考察。利用IR、1H-NMR、13C-NMR以及GC-MS對(duì)AMDS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，建立了相關(guān)的圖譜。依據(jù)AMDS的紫外光譜特征，確定了AMDS的最大吸收波長(zhǎng)，建立了測(cè)定含量的HPLC方法，方法學(xué)研究結(jié)

12、果表明線性關(guān)系和專屬性良好，回收率、精密度等符合要求。溶解度測(cè)定結(jié)果顯示AMDS在水中的溶解度為26μg·mL-1,油水分配系數(shù)正辛醇-水中脂水分配系數(shù)logP為2.68,屬于溶解度較低的脂溶性化合物。不同的增溶劑，會(huì)增加AMDS的溶解度，尤其以Tween80的增溶作用最強(qiáng)。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，溫度對(duì)于AMDS的穩(wěn)定性有較大的影響，在低溫條件下比較穩(wěn)定，因此原料的貯存條件應(yīng)為低溫保存。當(dāng)AMDS分散在不同溶劑中，加入抗氧劑會(huì)增加AMDS

13、在室溫條件下的穩(wěn)定性。
　　AMDS的固體化制劑研究評(píng)價(jià)了環(huán)糊精包合物、液固系統(tǒng)制劑和固體分散體三種劑型，研究重點(diǎn)是提高穩(wěn)定性、掩蓋氣味、減少胃刺激性。結(jié)果表明，采用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)以及磺丁基β-環(huán)糊精(SEB-β-CD)兩種材料制備的包合物載藥量和包封率都較β-環(huán)糊精(β-CD)低。因此選用β-CD作為包合材料，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的制備包合物的工藝條件為β-CD∶AMDS(w/w

14、)的投料比為6∶0.7,包合溫度為40℃，包合時(shí)間為4h。采用IR、DSC和1H-NMR對(duì)包合物進(jìn)行表征，結(jié)果表明包合成功。包合物穩(wěn)定性的考察結(jié)果顯示，制備的包合物大大增加了其穩(wěn)定性。其次，采用液固制備技術(shù)制備了固體顆粒。對(duì)制備條件進(jìn)行篩選，結(jié)果表明以PEG400為非揮發(fā)性的溶劑，以微晶纖維素∶乳糖(1∶1)為載體，以syloid(R) FP244為涂層材料，AMDS與PEG400比例為1∶1,（微晶纖維素+乳糖）與syloid(R)

15、FP244比例10∶1時(shí)制備的固體劑型的流動(dòng)性和載藥因子較好。對(duì)制備的液固劑型進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明在30℃±2℃3個(gè)月時(shí)藥物含量雖然有所降低，但與原藥相比穩(wěn)定性大大增加，長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫條件貯存穩(wěn)定。最后采用熔融法制備了AMDS的固體分散體，也提高了其穩(wěn)定性。對(duì)三種固化劑型的腸溶膠囊溶出度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明在3h藥物基本能完全溶出。制備的三種固體形式可以用于其他制劑的制備。
　　AMDS腸溶微丸制劑研究的重點(diǎn)包括素丸

16、的制備和微丸包衣。腸溶微丸技術(shù)進(jìn)一步提高了制劑的穩(wěn)定性，降低了胃刺激性。首先考察兩種不同的制備工藝制備微丸，結(jié)果表明采用空白丸芯載藥的離心造粒制丸法載藥量高、圓整度好?？疾炝瞬煌澈蟿┓N類、藥粉供給速度以及粘合劑的噴漿速度對(duì)微丸收率的影響，結(jié)果表明采用微晶纖維素為空白丸芯，3％的HMPC E5為粘合劑，藥粉的供給速度為10～15 r/min，噴漿速度為5～10 r/min時(shí)，微丸的收率較高和圓整度較好。對(duì)藥物微丸以Eudragit L3

17、0D-55水分散體為包衣材料進(jìn)行包衣，包衣液處方中添加PEG6000改善膜的通透性，加入滑石粉減少微丸的粘連。以收率和體外釋放度作評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)微丸的腸溶包衣進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)制備的三批腸溶微丸進(jìn)行體外釋放度考察，結(jié)果表明在酸中累計(jì)釋放率均小于7％，耐酸度良好，在pH6.8的緩沖溶液中AMDS在45 min累計(jì)釋放率達(dá)到75％以上，表明制備工藝可靠，質(zhì)量可行。腸溶微丸加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果顯示微丸的性狀、含量以及釋放度均未發(fā)生明顯的變化。

18、r>　　AMDS制劑的生物藥劑學(xué)研究包括主要代謝產(chǎn)物檢測(cè)和代謝動(dòng)力學(xué)研究組成。體內(nèi)代謝研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMDS在體內(nèi)代謝很快，沒有檢測(cè)到藥物原形，而是檢測(cè)到兩種主要的代謝產(chǎn)物AMSO和AMSO2。在多次給藥后，進(jìn)行藥物代謝產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與油性分散劑相比，給予AMDS腸溶微丸后能使其代謝產(chǎn)物AMSO2在大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0→∞分別提高至119％和173％，體內(nèi)滯留時(shí)間MRT延長(zhǎng)為134％，提示制備成微丸后可以延長(zhǎng)AMSO2的代謝