孤獨(dú)癥大鼠發(fā)病機(jī)制中突觸與神經(jīng)免疫功能異常的初步研究.pdf

1、目的：研究孤獨(dú)癥大鼠前額葉皮質(zhì)(Pregrontal cortex,PFC)與海馬(Hippocampus，HC)的突觸發(fā)育和神經(jīng)免疫功能的變化，及其兩者在孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：選用Wistar大鼠,在妊娠12.5(Emhanced12.5,E12.5)天時(shí)，一次性腹腔注射丙戊酸鈉（Valproic acid,VPA）復(fù)制子代孤獨(dú)癥大鼠模型。通過(guò)對(duì)比觀察對(duì)照組大鼠和孤獨(dú)癥模型組大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育（睜眼時(shí)間、負(fù)向性實(shí)驗(yàn)、游

2、泳實(shí)驗(yàn)）及行為學(xué)（自梳理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刻板動(dòng)作行為；三箱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)社會(huì)交往行為和對(duì)新事物的偏好行為）。運(yùn)用尼氏染色觀察出生第42天（Postnatal42,P42）對(duì)照組和模型組大鼠PFCⅡ/Ⅲ層與HC CA3區(qū)神經(jīng)元的變化。運(yùn)用Western blot分別檢測(cè)P42對(duì)照組和模型組神經(jīng)元特異性微管蛋白TUBB3,自噬相關(guān)蛋白Microtubule-associated protein1 light chain3-II(LC3-II)、Becli

3、n-1、P62，突觸相關(guān)蛋白Postsynapptic density protein95(PSD-95)、Gephyrin、突觸素(Synaptophysin,Syn），小膠質(zhì)細(xì)胞（Ionize calcium binging adapter molecule1，Iba1）和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)，炎性細(xì)胞因子Interleukin-6(IL-6)、Interleuki

4、n-1β(IL-1β)在前額葉皮質(zhì)和海馬的表達(dá)。運(yùn)用免疫組化觀察 P42對(duì)照組和模型組小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞在PFC和 HC齒狀回（Dentate gyrus,DG）中的數(shù)量、形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.發(fā)育狀態(tài)與對(duì)照組相比，模型組大鼠睜眼時(shí)間比正常組大鼠早；P13、P14、P15差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），P12、P16無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。負(fù)向性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P7、P8、P9模型組大鼠轉(zhuǎn)身時(shí)間較正

5、常組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），P10兩組子代鼠轉(zhuǎn)身時(shí)間無(wú)差異（P＞0.05）。游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在P9、P11、P13、P15時(shí)，與對(duì)照組大鼠相比，孤獨(dú)癥模型大鼠游泳能力顯著低下，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.行為學(xué)檢測(cè)自梳理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠理毛時(shí)間較對(duì)照組大鼠顯著增加（P＜0.05）；三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：前10min，對(duì)照組大鼠在第一只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間顯著長(zhǎng)于空箱子中停留時(shí)間（P＜0.01），模型組

6、大鼠在第一只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間與空箱子中停留時(shí)間無(wú)顯著差異（P＞0.05），后10min，對(duì)照組大鼠在第二只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間顯著長(zhǎng)于在第一只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間（P＜0.05），模型組大鼠在第二只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間與在第一只陌生鼠的箱子中停留時(shí)間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3.尼氏染色結(jié)果顯示：孤獨(dú)癥模型大鼠在PFC與HC神經(jīng)元數(shù)目均多于對(duì)照組大鼠，均存在顯著性差異（P＜0.05)。
　　4.Weste

7、rn blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P42,在PFC和 HC兩個(gè)腦區(qū)，孤獨(dú)癥模型組 TUBB3、P62、Syn、PSD-95、Iba1、GFAP、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05)；LC3-II、Beclin1、Gephyrin、蛋白表達(dá)水平比正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05)；
　　5.免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，孤獨(dú)癥模型組P42 Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞體增大，突起回縮并減少；

8、GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞體增大，突起增多。免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：孤獨(dú)癥模型組Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，孤獨(dú)癥模型組GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比正常組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　結(jié)論：P42，孤獨(dú)癥模型大鼠自噬活性降低；孤獨(dú)癥模型大鼠突觸發(fā)育異常——興奮性突觸增多，抑制性突觸減少，興奮性突觸/抑制性突觸失衡；孤獨(dú)癥模型大鼠神經(jīng)免疫失調(diào)——小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，炎