硒化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>&l

2、t;p>　　胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是由細(xì)菌和微型藻類在生長(zhǎng)過程中分泌到細(xì)胞外的長(zhǎng)鏈多糖。EPS常常以莢膜多糖和黏多糖兩種形式存在。但對(duì)于微生物來說，主要是指不與細(xì)胞表面永久粘附的黏多糖。微生物EPS具有增稠和凝膠的特性，已被用作工業(yè)中的增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑。但是，乳酸菌具有公認(rèn)的安全性。其產(chǎn)生的EPS可以替代工業(yè)微生物多糖廣泛用于食品配方中。而且，大量的研究證實(shí)乳酸菌產(chǎn)生EPS具有抗腫瘤活性、免

3、疫激活作用、降低血清膽固醇和益生元作用等，對(duì)人類的健康有著重要的意義。</p><p>　　硒元素是生命活動(dòng)的必需元素，其存在形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，常見的無機(jī)硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉，有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和對(duì)相關(guān)疾病的抵抗能力，這說明了硒與人體健康的直接關(guān)系。無機(jī)硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時(shí)劑量難以控制，而有機(jī)硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地

4、發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上比無機(jī)硒顯著，因此，將無機(jī)硒與多糖有機(jī)結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物———硒多糖，將會(huì)使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。</p><p>　　硒能作用于人體轉(zhuǎn)化成硒酶，大量破壞血管壁損傷處集聚的膽固醇，使血管保持暢通，提高心臟中輔酶A的水平，使心肌所產(chǎn)生的能量提高，從而保護(hù)心臟；硒是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分，它能防止胰島B細(xì)胞氧化破壞，使其功能正常，促進(jìn)糖份代謝、降低血糖和

5、尿糖，改善糖尿病患者的癥狀；硒是一種可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)和抑制細(xì)胞增殖的抗氧化微量元素，具有降低癌癥危險(xiǎn)的作用；硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—Px)的組成成分，每摩爾的GSH—Px中含4g原子硒，此酶的作用是催化還原性谷胱甘肽(GSH)與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，所以可發(fā)揮抗氧化作用，是重要的自由基清除劑。盡管硒在人體內(nèi)的含量非常少，而且每日攝人量也極微，但卻在人體的機(jī)能中發(fā)揮著極其重要的作用。硒在地殼中分布廣泛但含量不均。據(jù)WHO公布的資料

6、，全球有40多個(gè)國家屬于低硒和缺硒地區(qū)。對(duì)中國1094個(gè)縣市的土壤硒含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示：中國是個(gè)缺硒國家,全國有72％的人口存在不同程度的硒攝入不足。硒只占人體重量的萬分之一以下，不能在體內(nèi)合成，必須從食物中攝取，而且食物中的有機(jī)硒才容易被人體吸收。有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖，本文講述的是硒多糖。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　硒化乳

7、酸菌胞外多糖基本理化性質(zhì)確定。</p><p>　　測(cè)定多糖的抗氧化能力確定最適抗氧化濃度。</p><p>　　測(cè)定硒多糖的抗氧化能力并與多糖的抗氧化能力做比較，確定硒多糖的抗氧化能力。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　工藝路線 乳酸菌胞外多糖制取→抗氧化能力測(cè)定</p>&

8、lt;p>　　比較二者的抗氧化能力</p><p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖→抗氧化能力測(cè)定</p><p>　　1乳酸菌胞外粗多糖制取</p><p>　　采用BLX培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌，用冷凍干燥的方法制取乳酸菌胞外粗多糖</p><p><b>　　2 抗氧化能力測(cè)定</b></p><p&g

9、t;　　采用鄰苯三酚自氧化法，脫氧核糖氧化法等方法</p><p>　　3比較二者的抗氧化能力</p><p>　　確定乳酸菌胞外多糖的最適抗氧化濃度，再與硒酸化后的多糖的抗氧化能力進(jìn)行比較</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10.8—2010.12.30 查閱資料，整理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，并按照步驟進(jìn)行

10、實(shí)驗(yàn)。完成開題報(bào)告、文獻(xiàn)綜述、開題論證2011.1.10—2011.2.20 完成實(shí)驗(yàn)，外文翻譯2篇</p><p>　　2011.2.21—2011.5.10 整理數(shù)據(jù)、書寫論文，完成答辯</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 胡群寶,郭寶江.螺旋藻硒多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國海洋藥

11、物雜志,2001,5:18—20,29.</p><p>　　[2] 關(guān)玉梅.硒與缺硒對(duì)機(jī)體的影響[J].微量元素與健康研究,2002,18(4):83.</p><p>　　[3] 鄒宇,于俊林,徐晶,等.硒及微生物富硒研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,127(9):171—174.</p><p>　　[4] 王能才,等.硒微量元素臨床進(jìn)展[J].

12、醫(yī)學(xué)文選,2004,23(1):78-79.</p><p>　　[5] 鄒宇,于俊林,徐晶,等.硒及微生物富硒研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,127(9):171—174.</p><p>　　[6] 史麗英,羅世煒.微量元素硒的研究進(jìn)展[J].襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,4(1):108一l1O.</p><p>　　[7] WHANGERP

13、D.Selenium in the treatment of heavy metal poisoning and chemical carcinogenesis[J].J Trace Elem Eleetrolytes Health Dis,1992,6(4):209—211.</p><p>　　[8] 崔喬,尚德靜,鄒霞.硒多糖的研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2003,24(3):155—157.<

14、;/p><p>　　[9] Yang Ming,Wang Kui,Gao Lin.Exploration for a natural selenium supplement-characterization and bioactivities of Se-containing polysaccharide from garlic[J].JChim Pharm Sci,1992,1(1):28—32.</p&g

15、t;<p>　　[10] 吳應(yīng)亮,蔡宗源,何康明,等.富硒植物中硒化合物的提取和分析[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào),1994,15(3):70—73.</p><p>　　[11] 汪興平,莫開菊,周大.黃精含硒多糖的分離提取及含硒量分析技術(shù)研究[J].工藝研究食品科學(xué),2004,25(10):119—122.</p><p>　　[12] 于志,王萌.靈芝硒多糖的研究進(jìn)展與前景

16、[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(5):71—73.</p><p>　　[13] 溫磊,尚德靜,王偉靈.芝硒多糖的制備及其分離純化[J].中國食用菌,2005,24,(6):44—46.</p><p>　　[14] 陳海生,梁榮能,徐一新.野生云芝中水溶性多糖的分離鑒定[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,16(5).</p><p>　　[15] 王敏,

17、朱勁華,馬宇翔.含硒紫球藻胞外多糖的制備及對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].海洋科學(xué),2006,30(l):23—27.</p><p>　　[16] 陳國靜,彭佳明,潘麗元,等.香菇硒多糖抗腫瘤作用的研[J].中國誤診學(xué)雜志,2006,8,6(15):2893—2894.</p><p>　　[17] 徐春蘭,欽傳光,尚曉婭.EnterobacterCloacaeZ0206細(xì)菌胞外富

18、硒多糖的抗氧化活性[J].化學(xué)研究,2010,3,21(2)2010:64—68.</p><p>　　[18] 許峰,張瞳,周波.食用蕈菌硒多糖研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006,2,16(1):86—88.</p><p>　　[19] 唐家駿.硒化角叉菜膠的制備及其理化性質(zhì)和生化活性的研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1988,20(3):259—264.</p>

19、<p>　　[20] 龔曉鐘.硒化黃芪多糖與硒化葡萄糖的研究——硒化條件選擇[J].深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),1997,14(4):68—75.</p><p>　　[21] 蔣京,廖寶凉.N-含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(5):14—17.</p><p>　　[22] 方積年.多糖研究的現(xiàn)狀[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1986,2

20、1(12):944—950.</p><p>　　[23] 和朝軍,李景原,秦廣雍,等.靈芝硒多糖的研究進(jìn)[J].展河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,3:9—11.</p><p>　　[24] 徐輝碧,黃開勛.硒蛋白與硒多糖[J].科學(xué),1997,49(5):22—25</p><p>　　[25] 黃峙,鄭文杰,郭寶江等.含硒生物大分子化合物研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)

21、學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,19(2):169—175</p><p>　　[26] 陳春英,高秋華,涂歡,等.箬葉硒多糖提取液生物活性的初步研究[J].微量元素與健康研究,1994,11(4):33—34.</p><p>　　[27] 高林,尚德靜,崔喬.靈芝硒多糖SeGLP-1抑制小鼠肝腹水癌作用的研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2001,3:34—38.</p><

22、;p>　　[28] 鄧守恒,孫各琴,朱名安,等.硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣東微量元素科學(xué),2006,13(1):23—26.</p><p>　　[29] 門曉媛,王一飛,鄭文杰,等.納米硒化裙帶菜多糖的制備及其體外抗CVB3病毒作用研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(10):1153—1I55.</p><p>　　[30] 魏戰(zhàn)勇,崔保安,黃克

23、和,等.硒對(duì)豬細(xì)小病毒體外增殖抑制作用的研究[J].中國病毒學(xué).2005年12月第20卷第6期:613—617.</p><p>　　[31] 方敏.甲殼低聚糖硒的合成及其干預(yù)性糖尿病鼠模型形成的研究[D].南華大學(xué),2005.</p><p>　　[32] 張敖珍,劉雯,江明華.硒化卡拉膠對(duì)小鼠的降血糖作用[J].上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1993,20(5):385—387.</p&

24、gt;<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p><b>　　硒多糖的研究狀況</b></p><p>　　摘要：硒在有機(jī)體的生命活動(dòng)過程中具有重要的生物學(xué)作用，其中有些作用是與它的抗氧化作用密切相關(guān)的。硒多糖是硒的一

25、種有機(jī)形式，可以作為一種安全的補(bǔ)硒劑。本文綜述了硒多糖國內(nèi)外的一些研究近況以及硒多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生理生化作用，硒多糖同硒一樣具有體外抗氧化作用，抗腫瘤、抗病毒作用，以及降血糖、血脂等作用，而其活性比后者要高，并且利于機(jī)體吸收、安全，是一種理想的補(bǔ)硒劑。</p><p>　　關(guān)鍵詞：硒多糖；結(jié)構(gòu)；生理活性</p><p><b>　　0前言</b></p>

26、<p>　　硒元素是生命活動(dòng)的必需元素，其存在形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，常見的無機(jī)硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉，有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和對(duì)相關(guān)疾病的抵抗能力，這說明了硒與人體健康的直接關(guān)系。無機(jī)硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時(shí)劑量難以控制，而有機(jī)硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上比無機(jī)硒顯著[1]因此，將無機(jī)硒與多糖有機(jī)結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有

27、機(jī)硒化合物———硒多糖，將會(huì)使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。</p><p>　　硒能作用于人體轉(zhuǎn)化成硒酶，大量破壞血管壁損傷處集聚的膽固醇，使血管保持暢通，提高心臟中輔酶A的水平，使心肌所產(chǎn)生的能量提高，從而保護(hù)心臟[2]；硒是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分，它能防止胰島B細(xì)胞氧化破壞，使其功能正常，促進(jìn)糖份代謝、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的癥狀[3]；硒是一種可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)和抑制細(xì)胞增殖的抗氧化微量

28、元素，具有降低癌癥危險(xiǎn)的作用[4]；硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—Px)的組成成分，每摩爾的GSH—Px中含4g原子硒，此酶的作用是催化還原性谷胱甘肽(GSH)與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，所以可發(fā)揮抗氧化作用，是重要的自由基清除劑[5]。多糖本身也具有很多抗氧化活性[6]。從乳酸乳球菌乳酸亞種12的培養(yǎng)基中獲得了一種新型的胞外多糖（EPS）, 該胞外多糖表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化作用，展示了清除超氧陰離子和羥自由基的能力，和顯著降低丙二醛（MD

29、A）水平的能力。盡管硒在人體內(nèi)的含量非常少，而且每日攝人量也極微，但卻在人體的機(jī)能中發(fā)揮著極其重要的作用。硒在地殼中分布廣泛但含量不均。據(jù)WHO公布的資料，全球有40多個(gè)國家屬于低硒和缺硒地區(qū)。對(duì)中國1094個(gè)縣市的土壤硒含量進(jìn)行</p><p><b>　　1硒多糖的來源</b></p><p>　　天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，但含量較低，即使在高硒地區(qū)的富

30、硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相對(duì)較低。因此，研究者們?cè)噲D通過一些富硒手段如人工協(xié)迫富硒栽培、富硒酵母培養(yǎng)等，使生物體中硒多糖的硒含量增加。此外，通過多糖硒化修飾或化學(xué)合成等化學(xué)方法也可以獲得大量的硒多糖。</p><p><b>　　1.1天然硒多糖</b></p><p>　　目前成功獲得的天然硒多糖有靈芝硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻硒多糖、箸葉硒多糖和大蒜硒

31、多糖、黑木耳硒多糖等[9]。這些硒多糖主要是在富硒的環(huán)境下，植物或微生物通過特殊的代謝途徑利用環(huán)境中的無機(jī)硒合成的天然有機(jī)硒。湖北恩施州是我國最大也是世界罕見的高硒區(qū)，區(qū)內(nèi)含硒量比一般地區(qū)高出數(shù)十倍乃至數(shù)百倍，該地區(qū)一些常見的多糖類植物——大蒜、魔芋、板黨、南瓜等的硒多糖含量明顯高于其它地區(qū)的同種植物。1992年Yang等[10]從恩施地區(qū)的富硒大蒜中分離出一種硒多糖，通過高效液相色譜和紙色譜法測(cè)定為硒化的甘露聚糖。1994年吳應(yīng)亮等[

32、11]對(duì)恩施地區(qū)富硒植物——黃芪和魔芋進(jìn)行研究，提取精制出了硒多糖，測(cè)得其中的硒含量分別為1.06μg·g-1和1.55μg·g-1。2004年汪興平等[12]從富硒黃精中提取的多糖中測(cè)得硒的含量為0.5973μg/g。從天然靈芝中提取的靈芝硒多糖含量也很低[13]?？梢娭参镒匀桓患嗵堑奈咳匀缓艿汀?lt;/p><p>　　1.2微生物富集硒多糖</p><p>　

33、　微生物富集法獲取硒多糖，即在適宜的培養(yǎng)條件下將無機(jī)硒添加到真菌、藻類、細(xì)菌等的培養(yǎng)基中，通過微生物的生長(zhǎng)代謝，對(duì)硒進(jìn)行富集和生物轉(zhuǎn)化，從面獲得硒多糖。目前，通過人工協(xié)迫富硒培養(yǎng)法成功獲得的硒多糖不僅硒含量較高，而且種類繁多，例如真菌類的靈芝硒多糖、香菇硒多糖、木耳硒多糖、金針菇硒多糖等；藻類的螺旋藻硒多糖、綠色巴夫藻硒多糖等。2005年溫磊等[14]以靈芝為載體，通過靈芝菌絲體的深層培養(yǎng)，將無機(jī)的亞硒酸鈉加入培養(yǎng)基，通過生物轉(zhuǎn)化作用，

34、使無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并對(duì)富硒靈芝多糖進(jìn)行了分離純化[15]，從中篩選了對(duì)癌細(xì)胞有高抑制率的純化硒多糖。王敏等[16]采用在培養(yǎng)液中添加亞硒酸來實(shí)現(xiàn)藻對(duì)無機(jī)硒的富集和轉(zhuǎn)化，制備一種含硒的紫球藻(Porphyridiumsp．)胞外多糖(Se—PSP)可以延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，陳國靜等[17]將含硒化合物按設(shè)計(jì)比例重量加入香菇固體培養(yǎng)基中培育出富硒香菇,提取分離得硒多糖,并證明其具有比普通香菇多糖較高的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。徐春蘭等[18

35、]利用產(chǎn)多Enterobacter cloacae Z0206(E．cloacae Z0206)的深層發(fā)酵法制備了E．cl</p><p>　　1.3人工合成硒多糖</p><p>　　多糖含有多種基團(tuán)，例如自由羥基、醛基或酮基，這些基團(tuán)能夠與其它化合物發(fā)生特定的反應(yīng)，使多糖的硒化修飾或合成成為可能。到目前為止，人工合成硒多糖主要有以下3種方式：一是在溫和條件下使用單體硒、亞硒酸或亞硒酸鈉

36、等對(duì)多糖進(jìn)行硒化修飾；1988年唐家駿[20]首次用硒粉、濃硝酸與卡拉膠反應(yīng)制備出硒化卡拉膠，硒化Kappa價(jià)叉菜和lambda角叉菜膠中硒含量分別達(dá)到2512μg/g和1157μg/g。經(jīng)紅外光譜、激光拉曼光譜測(cè)定表明，硒化產(chǎn)物仍保持硫酸酯多糖的基本構(gòu)型，其中硒以不同形態(tài)存在，即角叉菜膠中部分硫被硒取代，形成硒酸酯，其末單元的3、6一內(nèi)醚，D一半乳糖在C一1位開環(huán)形式C-Se-H結(jié)構(gòu)。二是利用化學(xué)性質(zhì)活潑、具有酰氯結(jié)構(gòu)的SeOC1，作

37、為硒化試劑[21]；三是將含硒的功能基團(tuán)接枝到多糖分子上[22]。</p><p><b>　　2硒多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)</b></p><p>　　通過對(duì)硒多糖的分析發(fā)現(xiàn)，硒多糖的單糖組成一般分為兩類：①單一聚糖；②由Gal（半乳糖）、Glu（葡萄糖）、Rha（鼠李糖）、Xyl（木糖）、Fuc（巖藻糖）和Man（甘露糖）等多種單糖中的幾種組成的雜聚糖。各種單糖一般以D-構(gòu)

38、型存在，它們?cè)谖嗵欠肿又械谋壤膊槐M相同。多數(shù)硒多糖為β-構(gòu)型，α-構(gòu)型的硒多糖也有發(fā)現(xiàn)。硒多糖的主鏈一般是由1→3糖苷鍵鍵合而成，支鏈形式多樣，如以D-葡萄糖殘基、β-D-葡糖醛酸殘基、β-（1→6)-D-葡萄糖殘基、β-（1→2)-D-木糖殘基等作為支鏈。其它鍵合方式，如1→2糖苷鍵、1→4糖苷鍵較為少見。硒作為硒多糖的特征性部分，在硒多糖中的存在形式可能有SeH和R1—SeO—O—R2兩種[23]。實(shí)驗(yàn)表明，一種靈芝硒多糖是以α

39、-糖苷鍵鍵合成的吡喃多糖，由Glu、Man、Xyl、Gal和Rha組成[24]；大蒜硒多糖的平均分子量為15000，其水解產(chǎn)物經(jīng)HLPC和紙色譜分析，證明大蒜硒多糖含硒量約為12μg/g,其中硒可能以硒酸酯形式存在[25]。箬葉硒多糖是一種硒酸酯多糖[26]。螺旋藻硒多糖分子量為12590，由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-</p><p>　　3硒多糖的生理生化作用</p><p&g

40、t;　　多糖具有多種生理活性,是一種廣譜的免疫促進(jìn)劑,具有防癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫功能、延緩衰老、抗感染、抗輻射等生理作用[23]。活性氧自由基對(duì)生物分子起損害作用,甚至造成DNA鏈斷裂或變異,硒則對(duì)因脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基具有清除作用。硒多糖兼有多糖和硒兩方面的功能,因此表現(xiàn)出更有效的生理活性,在醫(yī)藥研制和疾病治療等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。</p><p><b>　　3.1抗氧化作用</b>&

41、lt;/p><p>　　谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能分解過氧化物,減少自由基的產(chǎn)生,保護(hù)臟器免受自由基的侵害,在疾病防治過程中具有重要的作用。硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心,因此硒的新陳代謝對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化能力具有重要的影響,硒多糖作為一種硒源物質(zhì)不僅能夠有效地補(bǔ)給硒的代謝,而且本身具有抗氧化作用,能夠顯著提高動(dòng)物的抗氧化能力。</p><p>　　陳春英等[27]用箬葉多糖與硒化

42、合物反應(yīng)得到箬葉硒多糖,并發(fā)現(xiàn)箬葉硒多糖能有效地提高血液中的硒含量和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,顯著降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量,增強(qiáng)紅細(xì)胞抗H2O2氧化損傷的能力,具有明顯的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。徐春蘭等[19]利用產(chǎn)多糖菌 Enterobacter cloacae Z0206(E．cloacae Z0206)的深層發(fā)酵法制備了E．cloacae Z0206細(xì)菌富硒多糖。E．cloacae Z0206富硒多糖對(duì)DPPH自由基和羥自由基具有較好

43、的清除作用，在濃度為5g/L時(shí)對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率分別為80.35%和84.26%，并具有較強(qiáng)的還原能力。</p><p><b>　　3.2抗腫瘤作用</b></p><p>　　硒多糖不僅能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng),而且能夠直接殺傷或殺死癌細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。高林等[28]發(fā)現(xiàn)靈芝硒多糖比靈芝多糖有更顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性,而且這種抑瘤

44、活性與硒多糖的分子組成以及分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。胡群寶等[1]在研究螺旋藻硒多糖的藥理作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,并且這種抑瘤作用與硒多糖對(duì)動(dòng)物免疫功能的影響沒有關(guān)系。鄧守恒等[29]研究硒化殼聚糖對(duì)NB4急性早幼粒白血病腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn),硒化殼聚糖可有效地抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng),并呈量效和時(shí)效關(guān)系,細(xì)胞明顯出現(xiàn)核固縮、碎裂等凋亡形態(tài)的改變,顯示硒化殼聚糖具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。</p><p><b>

45、;　　3.3抗病毒作用</b></p><p>　　門曉媛等[30]制備出了納米硒化裙帶菜多糖并觀察其體外抗柯薩奇CVB3病毒(腸道病毒屬)的作用。結(jié)果表明,硒多糖具有良好的體外抗CVB3病毒的活性,在安全性和有效性上均超過常用的抗病毒藥物病毒唑(Ribavirin)。魏戰(zhàn)勇等[31]通過研究發(fā)現(xiàn)海藻硒多糖對(duì)豬細(xì)小病毒體外復(fù)制有抑作用。但其效果不如硒蛋氨酸和亞硒酸鈉顯著，可能是由于不同硒化合物的含硒形

46、式和結(jié)構(gòu)不同而造成的。對(duì)于海藻硒多糖抑制病毒所需的有效濃度，尚有待于進(jìn)一步的研究。</p><p>　　3.4降血糖、降血脂作用</p><p>　　糖尿病是一種常見的糖、脂代謝紊亂的臨床綜合癥,主要是由于胰島素生物活性的降低或者效應(yīng)不足引起的。硒多糖通過保護(hù)胰島細(xì)胞,改善胰島素的敏感性,從而對(duì)糖尿病起到干預(yù)作用。方敏[32]在合成硒化甲殼低聚糖的基礎(chǔ)上,研究其對(duì)糖尿病鼠模型形成的干預(yù)作用

47、及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),硒化甲殼低聚糖能夠顯著抑制模型動(dòng)物血糖和膽固醇的提高,并明顯提高GSH2Px的活性,表明硒化甲殼低聚糖能夠改善動(dòng)物的糖、脂代謝。張敖珍等[33]發(fā)現(xiàn)硒化卡拉膠可使正常小鼠以及四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖降低,而且對(duì)正常小鼠注射腎上腺素所引起的高血糖也有降低作用。硒多糖良好的降糖作用已經(jīng)引起糖尿病專家及廣大學(xué)者的注意,在開發(fā)糖尿病藥物或保健食品方面顯現(xiàn)出誘人的前景。</p><p><b&g

48、t;　　4前景與展望</b></p><p>　　前文中許多研究表明硒對(duì)人體的健康是缺一不可的，而由于硒的分布不規(guī)律，使很多人存在缺硒而致病的危險(xiǎn)，特別在我們中國這個(gè)人口大國，竟然有72%的人口存在硒攝入不足的問題，硒多糖作為硒的一種有機(jī)形式，不僅活性比無機(jī)硒要高，而且其在機(jī)體中的吸收好，不會(huì)像無機(jī)硒一樣在體內(nèi)造成蓄積性制毒，因此硒多糖是一種理想的補(bǔ)硒劑，有很廣闊的開發(fā)前景。</p>&

49、lt;p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 胡群寶,郭寶江.螺旋藻硒多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國海洋藥物雜志,2001,5:18—20,29.</p><p>　　[2] 關(guān)玉梅.硒與缺硒對(duì)機(jī)體的影響[J].微量元素與健康研究,2002,18(4):83.</p><p>　　[3] 鄒宇,于俊林,徐晶,等

50、.硒及微生物富硒研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,127(9):171—174.</p><p>　　[4] 王能才,等.硒微量元素臨床進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)文選,2004,23(1):78-79.</p><p>　　[5] 鄒宇,于俊林,徐晶,等.硒及微生物富硒研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,127(9):171—174.</p><p>　　[6]

51、 Daodong Pan, Xiuming Mei. Antioxidant activity of an exopolysaccharide purified from Lactococcus lactis subsp.lactis 12[J]. Carbohydrate Polymers, 80(2010):908-914</p><p>　　[7] 史麗英,羅世煒.微量元素硒的研究進(jìn)展[J].襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)

52、院學(xué)報(bào),2005,4(1):108一l1O.</p><p>　　[8] WHANGERPD.Selenium in the treatment of heavy metal poisoning and chemical carcinogenesis[J].J Trace Elem Eleetrolytes Health Dis,1992,6(4):209—211.</p><p>　　[

53、9] 崔喬,尚德靜,鄒霞.硒多糖的研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2003,24(3):155—157.</p><p>　　[10] Yang Ming,Wang Kui,Gao Lin.Exploration for a natural selenium supplement-characterization and bioactivities of Se-containing polysaccharide

54、 from garlic[J].JChim Pharm Sci,1992,1(1):28—32.</p><p>　　[11] 吳應(yīng)亮,蔡宗源,何康明,等.富硒植物中硒化合物的提取和分析[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào),1994,15(3):70—73.</p><p>　　[12] 汪興平,莫開菊,周大.黃精含硒多糖的分離提取及含硒量分析技術(shù)研究[J].工藝研究食品科學(xué),2004,25(10):11

55、9—122.</p><p>　　[13] 于志,王萌.靈芝硒多糖的研究進(jìn)展與前景[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(5):71—73.</p><p>　　[14] 溫磊,尚德靜,王偉靈.芝硒多糖的制備及其分離純化[J].中國食用菌,2005,24,(6):44—46.</p><p>　　[15] 陳海生,梁榮能,徐一新.野生云芝中水溶性多糖的分離鑒定[J].

56、解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,16(5).</p><p>　　[16] 王敏,朱勁華,馬宇翔.含硒紫球藻胞外多糖的制備及對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].海洋科學(xué),2006,30(l):23—27.</p><p>　　[17] 陳國靜,彭佳明,潘麗元,等.香菇硒多糖抗腫瘤作用的研[J].中國誤診學(xué)雜志,2006,8,6(15):2893—2894.</p><p>

57、　　[18] 徐春蘭,欽傳光,尚曉婭.EnterobacterCloacaeZ0206細(xì)菌胞外富硒多糖的抗氧化活性[J].化學(xué)研究,2010,3,21(2)2010:64—68.</p><p>　　[19] 許峰,張瞳,周波.食用蕈菌硒多糖研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006,2,16(1):86—88.</p><p>　　[20] 唐家駿.硒化角叉菜膠的制備及其理化性質(zhì)和生化活性的研究

58、[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1988,20(3):259—264.</p><p>　　[21] 龔曉鐘.硒化黃芪多糖與硒化葡萄糖的研究——硒化條件選擇[J].深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),1997,14(4):68—75.</p><p>　　[22] 蔣京,廖寶凉.N-含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(5):14—17.</p>

59、<p>　　[23] 方積年.多糖研究的現(xiàn)狀[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1986,21(12):944—950.</p><p>　　[24] 和朝軍,李景原,秦廣雍,等.靈芝硒多糖的研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,3:9—11.</p><p>　　[25] 徐輝碧,黃開勛.硒蛋白與硒多糖[J].科學(xué),1997,49(5):22—25</p><p>　

60、　[26] 黃峙,鄭文杰,郭寶江等.含硒生物大分子化合物研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,19(2):169—175</p><p>　　[27] 陳春英,高秋華,涂歡,等.箬葉硒多糖提取液生物活性的初步研究[J].微量元素與健康研究,1994,11(4):33—34.</p><p>　　[28] 高林,尚德靜,崔喬.靈芝硒多糖SeGLP-1抑制小鼠肝腹水癌作用的研究

61、[J].食用菌學(xué)報(bào),2001,3:34—38.</p><p>　　[29] 鄧守恒,孫各琴,朱名安,等.硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣東微量元素科學(xué),2006,13(1):23—26.</p><p>　　[30] 門曉媛,王一飛,鄭文杰,等.納米硒化裙帶菜多糖的制備及其體外抗CVB3病毒作用研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(10):1153—1155.<

62、;/p><p>　　[31] 魏戰(zhàn)勇,崔保安,黃克和,等.硒對(duì)豬細(xì)小病毒體外增殖抑制作用的研究[J].中國病毒學(xué),2005, 20(6):613—617.</p><p>　　[32] 方敏.甲殼低聚糖硒的合成及其干預(yù)性糖尿病鼠模型形成的研究[D].南華大學(xué),2005.</p><p>　　[33] 張敖珍,劉雯,江明華.硒化卡拉膠對(duì)小鼠的降血糖作用[J].上海醫(yī)科大學(xué)

63、學(xué)報(bào),1993,20(5):385—387.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　硒化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究 </p><p><b>　　目錄</b></p><

64、;p><b>　　0 前言14</b></p><p>　　1 材料與方法15</p><p><b>　　1.1材料15</b></p><p>　　1.2 儀器與設(shè)備15</p><p><b>　　1.3 試劑15</b></p><p

65、>　　1.4理化性質(zhì)的測(cè)定15</p><p>　　1.4.1多糖的溶解性15</p><p>　　1.4.2多糖的鑒別與分析16</p><p>　　1.4.3乳酸菌胞外多糖多糖成分分析16</p><p>　　1.4.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制16</p><p>　　1.4.3.2 水解多糖樣品的

66、制備17</p><p>　　1.4.3.3 展開系統(tǒng)及顯色劑的配制17</p><p>　　1.4.3.4 點(diǎn)樣17</p><p>　　1.4.3.5 展層17</p><p>　　1.4.3.6 顯色17</p><p>　　1.4.3.7 Rf值的測(cè)定方法17</p><p>

67、;　　1.5 體外抗氧化活性的測(cè)定17</p><p>　　1.5.1 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定17</p><p>　　1.5.2 羥自由基（·OH）清除能力測(cè)定18</p><p>　　1.5.3 總抗氧化能力測(cè)定18</p><p>　　2 結(jié)果與分析18</p><

68、p>　　2.1 硒化乳酸菌胞外多糖理化性質(zhì)的測(cè)定18</p><p>　　2.1.1 硒化乳酸菌胞外多糖的溶解性測(cè)定18</p><p>　　2.1.2 硒化乳酸菌胞外多糖的鑒別與分析18</p><p>　　2.1.2.1 碘-碘化鉀反應(yīng)18</p><p>　　2.1.2.2 Molish反應(yīng)19</p>

69、<p>　　2.1.2.3 茚三酮反應(yīng)19</p><p>　　2.1.3 硒化乳酸菌胞外多糖多糖成分分析19</p><p>　　2.2 硒化與未經(jīng)硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)超氧自由基（O2-）的清除作用19</p><p>　　2. 硒化與未經(jīng)硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)羥自由基（·OH）清除作用20</p><p>

70、　　2.4 硒化與未經(jīng)硒化乳酸菌胞外多糖總抗氧化能力21</p><p><b>　　3 結(jié)論22</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)23</b></p><p>　　摘要：本文對(duì)制備的硒化乳酸菌胞外多糖進(jìn)行了理化性質(zhì)及其抗氧化活性的

71、研究。通過理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)得出，它是一種溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿等有機(jī)溶劑的不含淀粉多糖的多糖；通過硒化與未經(jīng)硒化乳酸菌胞外多糖清除超氧自由基，羥自由基的能力以及他們的總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)果，經(jīng)硒化的乳酸菌胞外多糖在多糖濃度為8mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除率為61.25%，相比硒化前的多糖在同樣濃度下對(duì)超氧陰離子自由基的清除率41.74%提高了19.51%；而在多糖濃度為8mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基的清除率從54.94%7提高到

72、4.18%，提高了19.24%；在多糖濃度為10mg/mL時(shí)，硒多糖的總抗氧化能力為9.7(U/L)，未經(jīng)硒化的總抗氧化能力7.4(U/L)，提高了2.3(U/L)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：乳酸菌；硒多糖；抗氧化活性；理化性質(zhì)</p><p>　　Abstract：A research of physical and chemical properties and antioxida

73、nt activity to selenium exopolysaccharides of lactic acid bacteria in this paper. The physical and chemical properties experiments showed that selenium exopolysaccharides of lactic acid bacteria is a polysaccharide that

74、soluble in water but insoluble in organic solvents like ethanol, acetone, chloroform,etc, and is non-starch polysaccharides; The scavenging of superoxide radical and hydroxyl radical and total antioxidant capaci</p>

75、;<p>　　Keywords：Lactic acid bacteria; Selenium Polysaccharide; Antioxidant activity; Physical and Chemical Properties </p><p><b>　　0 前言</b></p><p>　　乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染

76、色陽性細(xì)菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。從廣泛意義上講，這是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，目前至少可分為18個(gè)屬，共有200多種。除極少數(shù)外，其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內(nèi)外生物學(xué)家所證實(shí)，腸內(nèi)乳酸菌與健康長(zhǎng)壽有著非常密切的直接關(guān)系，具有抑菌消炎，抗氧化、抗腫瘤，降低膽固醇，提高免疫力等功效[1,2]。</p><p>

77、　　胞外多糖(Exopolysaccharides．EPS)是由細(xì)菌和微型藻類在生長(zhǎng)過程中分泌到細(xì)胞外的長(zhǎng)鏈多糖。EPS常常以莢膜多糖和黏多糖兩種形式存在，但對(duì)于微生物來說,主要是指不與細(xì)胞表面永久粘附的黏多糖[3]。多糖的提取工藝在國內(nèi)外的研究已經(jīng)有很多[4]。微生物EPS具有增稠和凝膠的特性，已被用作工業(yè)中的增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑。但是，乳酸菌具有公認(rèn)的安全性,其產(chǎn)生的EPS可以替代工業(yè)微生物多糖廣泛用于食品配方中。而且，大量的研究

78、證實(shí)乳酸菌產(chǎn)生的EPS具有抗腫瘤活性、免疫激活作用、降低血清膽固醇和益生元作用等，對(duì)人類的健康有著重要的意義[5]。因此，乳酸菌EPS作為食品級(jí)生物添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)，甚至應(yīng)用于醫(yī)藥和工業(yè)中的潛力很大，認(rèn)識(shí)、改造和利用乳酸菌EPS對(duì)于提升食品的質(zhì)量和增加食品的功能具有重要意義。近幾十年來, 由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的特殊優(yōu)勢(shì)而得到大力研究和開發(fā), 微生物胞外多糖的開發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點(diǎn)之一。由于乳酸菌

79、是食品級(jí)工業(yè)生產(chǎn)菌, 與其他菌相比安全性高, 所以近年來對(duì)乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多。</p><p>　　硒是動(dòng)物和人體中一些抗氧化酶（谷胱甘肽過氧化物酶）和硒-P蛋白的重要組成部分，在體內(nèi)起著平衡氧化還原氛圍的作用，研究證明具有提高動(dòng)物免疫力作用，在國際上硒對(duì)于免疫力影響和癌癥預(yù)防的研究是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，因此，硒可作為動(dòng)物飼料微量添加劑，也在植物肥料中添加微量元素肥，提高農(nóng)副產(chǎn)品含硒量。硒已被作為人體必需

80、的微量元素，目前，中國營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的成人攝入量為每日50-250微克，而我國2/3地區(qū)硒攝入量低于最低推薦值，因此，中國是一個(gè)既有豐富硒資源，又存在大面積硒缺乏地區(qū)，這也是國際學(xué)者對(duì)中國感興趣的原因。</p><p>　　硒多糖是硒的一種有機(jī)存在形式，相對(duì)無機(jī)硒[6]而言有機(jī)硒[7]毒性低、副作用小，能夠更好地發(fā)揮硒的生理活性[8]。有機(jī)硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有無機(jī)硒的多種

81、活性，還具有多糖的各種生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被機(jī)體吸收利用[9]。天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，但含量較低，即使在高硒地區(qū)的富硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相對(duì)較低。因此，研究者們?cè)噲D通過一些富硒手段如人工協(xié)迫富硒栽培、富硒酵母培養(yǎng)等，使生物體中硒多糖的硒含量增加。此外，通過多糖硒化修飾或化學(xué)合成等化學(xué)方法也可以獲得大量的硒多糖[10]。已經(jīng)有不少關(guān)于硒多糖的研究，如孫蘭萍，張勝義，許暉對(duì)硒化殼

82、聚糖的研究[11]，張威,王敏,朱勁華等對(duì)硒化紫球藻胞外多糖的研究[12]，溫磊，尚德靜，王偉對(duì)靈芝硒多糖的研究[13]。但是對(duì)微生物的硒化多糖的研究還不多見。</p><p>　　硒化乳酸菌胞外多糖是實(shí)驗(yàn)室人工合成的微生物硒多糖，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)制備得到的硒多糖進(jìn)行初步的理化性質(zhì)分析及抗氧化活性研究，通過比較硒化前后乳酸菌胞外多糖的抗氧化活性，初步明確其抗氧化活性是否優(yōu)于未經(jīng)硒化的乳酸菌胞外多糖，為硒化乳酸菌胞外多糖

83、的開發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材料</b></p><p>　　a 乳酸菌胞外多糖：由實(shí)驗(yàn)室制備所得</p><p>　　b 硒化乳酸菌胞外多糖：將一定量的乳酸菌胞外多糖粉末放入三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的硝酸水溶液

84、10ml，加熱攪拌使多糖全部溶解，再經(jīng)水浴加熱到相應(yīng)的溫度，加入相應(yīng)量的Na2SeO3和BaCl2，反應(yīng)相應(yīng)的時(shí)間后。冷卻到室溫，用Na2CO3調(diào)pH5-6，加入適量無水Na2SO3沉淀反應(yīng)液中的氯化鋇，用高速冷凍離心機(jī)下在5000r/min的條件下離心20min后取上清液，再用無水乙醇沉淀(4℃冰箱過夜)，收集沉淀，透析24h，冷凍干燥后，即為硒多糖。</p><p><b>　　1.2 儀器與設(shè)備&

85、lt;/b></p><p>　　湘儀-H2500R離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司</p><p>　　KDT23可見光分光光度計(jì) 上海科登精密儀器有限公司</p><p>　　湘儀-H2050R離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司 <

86、/p><p>　　LDZX—50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠</p><p>　　DHG-9108A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　PHS-3C型酸度計(jì) 上海盛磁儀器有限公司</p><p>　　電子天平

87、 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　硅膠板 上海信誼儀器廠</p><p>　　WFZ UV-4802H 型 紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司</p><p>　　DK-8D 型 電熱恒溫水槽

88、 上海一恒科技有限公司</p><p>　　其他：通風(fēng)柜，電冰箱，移液槍，移液管，錐形瓶，試管，燒杯，電熱恒溫水浴鍋等。</p><p><b>　　1.3 試劑</b></p><p>　　總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），乙酸乙酯（天津市博迪化工有限公司），吡啶（上海展云化工有限公司），苯胺（國藥集團(tuán)

89、化學(xué)試劑有限公司），二苯胺（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），D-木糖（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆珼-半乳糖（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?，葡萄糖（上海展云化工有限公司），D-果糖（Aladdin Chemistry Co.Ltd.），L-鼠李糖（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆琓ris，鄰苯三酚，濃HCl，鄰二氮菲，磷酸鹽，F(xiàn)eSO4，H2O2，無水乙醇，丙酮，氯仿，NaOH，磷酸均為國產(chǎn)級(jí)分析純</p><p>　　1.4理化性質(zhì)

90、的測(cè)定</p><p>　　1.4.1多糖的溶解性[14]</p><p>　　多糖類物質(zhì)由于其分子中含有大量的極性基團(tuán)，因此對(duì)于水分子具有較大的親和力；但是一般多糖的分子量相當(dāng)大，其疏水性也隨之增大；因此分子量較小，分支程度低的多糖類在水中有一定的溶解度，加熱情況下更溶液溶解；而分子量大，分支程度高的多糖類在水中溶解度低。</p><p>　　多糖一般不溶于高濃度

91、的有機(jī)溶劑。</p><p>　　在25℃下將0.2g硒化乳酸菌胞外多糖分別溶于水，乙醇，丙酮，氯仿四種不同的溶劑中，24h后觀察其溶解性。</p><p>　　稱取4份0.2g的硒化乳酸菌胞外多糖于事先準(zhǔn)備好的10mL的小燒杯中，在燒杯壁上貼上標(biāo)簽，注明水，乙醇，丙酮，氯仿四種不同的溶劑，然后根據(jù)標(biāo)簽往燒杯中分別倒入四種高濃度溶劑，以倒入燒杯總量的2/3為宜。倒入后輕輕搖晃小燒杯，使多糖

92、與溶劑充分接觸，用保鮮膜封住杯口，在25℃放置24h。</p><p>　　1.4.2多糖的鑒別與分析[15-18]</p><p>　　如果多糖遇碘變藍(lán)，說明多糖為淀粉多糖，因此可以用碘檢測(cè)多糖。取lml濃度為1mg／ml的硒多糖溶液加入碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對(duì)照，淀粉溶液(1mg／m1)作陽性對(duì)照。</p><p>　　糖在濃硫酸或濃鹽酸的

93、作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物，在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。自由存在和結(jié)合存在的糖均呈陽性反應(yīng)。此外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈顏色近似的陽性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒有糖類物質(zhì)的存在；而陽性反應(yīng)，則說明有糖存在的可能性，需要進(jìn)一步通過其他糖的定性試驗(yàn)才能確定有糖的存在。取lml濃度為lmg／ml的硒多糖溶液，加入2滴Molish試劑，搖勻，將試管傾斜，沿試管壁慢

94、慢加入lml濃硫酸，豎直試管，觀察濃硫酸和糖溶液交界面顏色變化。以蒸餾水作為陰性對(duì)照，淀粉溶液（1mg／m1）作為陽性對(duì)照。</p><p>　　茚三酮與氨基酸、肽類或蛋白質(zhì)的自由α氨基或其他氨基化合物所產(chǎn)生的一種可定量的顯色反應(yīng)。所呈現(xiàn)的顏色隨反應(yīng)的條件（酸度、溫度、鹽濃度、銅、鎘離子等）不同而異。用于氨基酸和肽的層析及定量測(cè)定。取lml濃度為lmg/ml的硒多糖溶液，加入0.5ml的0.1%茚三酮乙醇溶液，搖

95、勻，沸水浴2min，冷卻，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對(duì)照，0.5%甘氨酸溶液作陽性對(duì)照。</p><p>　　1.4.3乳酸菌胞外多糖多糖成分分析[19-21]</p><p>　　薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固－液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣

96、品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。</p><p>　　1.4.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 </p><p>　　

97、分別稱取葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖，分別溶于蒸餾水中制得五種單糖標(biāo)準(zhǔn)液，濃度均為1mg/mL。</p><p>　　1.4.3.2 水解多糖樣品的制備 </p><p>　　稱取20mg硒多糖，溶解在5mL蒸餾水中，加入12mol/L的HCl 0.25mL，置于高壓釜中，在121℃條件下水解4h，中和后稀釋至10mL，離心。</p><p>　　1

98、.4.3.3 展開系統(tǒng)及顯色劑的配制 </p><p>　　展開系統(tǒng)：分別把乙酸乙酯、吡啶、無水乙醇、水按8：1：1：2（V/V）的比例混合搖勻。顯色劑的配制（苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑）：2%二苯胺丙酮溶液：2%苯胺丙酮溶液：85%磷酸按5：5：1（V/V）的比例混合搖勻。</p><p>　　1.4.3.4 點(diǎn)樣 </p><p>　　將葡萄糖、鼠李糖、木糖、

99、果糖、半乳糖、甘露糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)液和處理過的樣品液，7種液體按順序分別點(diǎn)樣在薄層板上。點(diǎn)樣量約10μL，分次滴加，使點(diǎn)樣擴(kuò)散后直徑不超過2mm。點(diǎn)樣過程中用吹風(fēng)機(jī)使樣品干燥。</p><p>　　1.4.3.5 展層 </p><p>　　將點(diǎn)好樣品的薄層板置于密閉的層析缸中，用配制的展開劑，采用傾斜上行法，將薄層板的下端浸在展開劑中0.3-0.5cm，至展開劑距離薄層板的上端約1cm左右

100、時(shí)取出自然風(fēng)干。</p><p>　　1.4.3.6 顯色 </p><p>　　在除去溶劑后的薄層板上，均勻噴上顯色劑，置于烘箱中顯色，烘箱中加熱顯色溫度一般選擇85℃為宜，顯色時(shí)間10min。</p><p>　　1.4.3.7 Rf值的測(cè)定方法</p><p>　　被測(cè)物質(zhì)在薄板上的移動(dòng)速率可用比值Rf值表示：</p>

101、<p>　　1.5 體外抗氧化活性的測(cè)定[22-24] </p><p>　　1.5.1 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定[25-29] </p><p>　　采用鄰苯三酚自氧化法，鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，釋放出O2-·，生成有色的中間產(chǎn)物，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)有清除劑存在時(shí)，O2-·被清除，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，使鄰苯三

102、酚自氧化速率降低，表現(xiàn)為體系的吸光度降低，所以可通過比色法檢測(cè)有色中間產(chǎn)物的含量，進(jìn)而檢驗(yàn)待測(cè)物質(zhì)清除O2-·的能力，因此加入一定量的具有抗氧化作用的不同濃度的多糖液可對(duì)O2-·產(chǎn)生不同的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致光吸收值的變化。配制50mmol/L Tris-HCl緩沖液（PH=8.2），3mmol/L的鄰苯三酚溶液和不同濃度的樣品溶液。</p><p>　　取濃度為50mmol/L Tris-HC

103、l緩沖液（PH=8.2）4.5mL，加蒸餾水4.2 mL，混勻后在25℃水浴保溫20min，取出后立即加入樣品2 mL，蒸餾水2.2 mL，25℃保溫的、濃度為3mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL（以10mmol/L HCl配制，空白管中以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液），迅速搖勻倒入比色杯，置于25℃恒溫池中，在325nm下每隔30s測(cè)一次；測(cè)啟動(dòng)后4min內(nèi)樣品抑制鄰苯三酚自氧化的速率，記作V樣，測(cè)空白樣反應(yīng)啟動(dòng)后4min

104、內(nèi)鄰苯三酚自氧化的速率，記作V0。每測(cè)一個(gè)濃度配一次測(cè)樣液，而且配完了就要馬上測(cè)定，否則反應(yīng)結(jié)束了就沒法測(cè)速率了。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率E％表示，計(jì)算公式如下： </p><p>　　E％=（V0-V樣）/V0×100</p><p>　　以清除率為依據(jù)確定有規(guī)律變化的濃度范圍為最適濃度范圍。</p><p>　　1

105、.5.2 羥自由基（·OH）清除能力測(cè)定[30-32]</p><p>　　采用Fenton體系，其原理是該物質(zhì)在536nm處有吸收峰，F(xiàn)eSO4 與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多，如果在反應(yīng)體系中加入有清除·OH能力的物質(zhì)，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，使有色物質(zhì)生成量減少，在536n

106、m處測(cè)各濃度的吸光度。配制5mmol/L 鄰二氮菲溶液，130 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PH=7.4），5 mmol/L的FeSO4溶液，0.1%的H2O2溶液和不同濃度的樣品溶液。</p><p>　　取5mmol/L 鄰二氮菲溶液0.6mL，加入濃度為130 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PH=7.4）1 mL，混勻后加入濃度為5 mmol/L的FeSO4溶液0.6mL，充分混勻，加入樣品液2 mL，0.1%的

107、H2O2溶液0.4 mL，搖勻，37℃保溫60min，把所有樣品還有兩個(gè)對(duì)照管（損傷管，按照上述操作，用蒸餾水代替樣品溶液，未損傷，用蒸餾水代替樣品和H2O2溶液），最后以水補(bǔ)充至體積為5 mL，配制好后，用分光光度計(jì)儀器進(jìn)行測(cè)定，在536nm處測(cè)定上述溶液的分光度，每測(cè)好一個(gè)就把數(shù)據(jù)記錄下來。</p><p><b>　　計(jì)算公式如下：</b></p><p>　　

108、·OH清除率=（A樣品-A損傷）/(A未損傷-A損傷)×100</p><p>　　以清除率為依據(jù)確定有規(guī)律變化的濃度范圍為最適濃度范圍。</p><p>　　1.5.3 總抗氧化能力測(cè)定 </p><p>　　采用總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒測(cè)定。根據(jù)（T-AOC）測(cè)定試劑盒的使用說明書配置好溶液和不同濃度的樣品溶液。根據(jù)總抗氧化能力試