miR-374a的發(fā)現(xiàn)及其靶基因在MERS-CoV感染致病過(guò)程中的作用探索.pdf

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)是一種目前新發(fā)現(xiàn)的最大的RNA病毒，具有致病性強(qiáng)、致死率高的特點(diǎn)，其感染和傳播給人類帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。但是，目前關(guān)于MERS-CoV的致病通路的有關(guān)研究很少。microRNA（miRNA）作為一類新型的調(diào)控因子，在病毒致病過(guò)程中起到非常重要的作用。本課題從miRNA角度對(duì)MERS-CoV的致病通路進(jìn)行了研究，有利于進(jìn)一步闡明MERS-CoV與宿主之間的相互作用，并為發(fā)現(xiàn)抗MERS-CoV的藥物提供

2、新的靶點(diǎn)和策略。
　　研究目的:探索體內(nèi)重要調(diào)控分子miRNA在MERS-CoV致病過(guò)程中的作用及相關(guān)調(diào)控分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.MERS-CoV感染后的致病通路探索:①M(fèi)ERS-CoV感染致病相關(guān)miRNA篩選:預(yù)測(cè)分析可能在MERS-CoV感染致病過(guò)程中具有重要作用的miRNA。通過(guò)MERS-CoV感染的細(xì)胞miRNA表達(dá)譜芯片的差異分析，選擇信號(hào)值有明顯變化的miRNA，利用MTT實(shí)驗(yàn)篩選出可能在ME

3、RS-CoV感染致病過(guò)程中具有重要作用的miRNA，qPCR驗(yàn)證MERS-CoV感染后該miRNA在胞內(nèi)的表達(dá)。②檢測(cè)miR-374a對(duì)細(xì)胞增殖的影響:將miR-374a mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-374a的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。③預(yù)測(cè)分析miR-374a可能靶向的靶基因:通過(guò)MERS-CoV感染的細(xì)胞mRNA表達(dá)譜芯片的差異分析，綜合在線分析(Targetscan，pichtar)等方法預(yù)測(cè)miR-37

4、4a的靶基因，取預(yù)測(cè)交集，預(yù)測(cè)到miR-374a可能靶向BolA33'UTR，qPCR驗(yàn)證分析的結(jié)果。④通過(guò)qPCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了miR-374a在mRNA和蛋白質(zhì)水平上對(duì)BolA3表達(dá)的影響。⑤miR-374a對(duì)BolA3的靶向性研究:構(gòu)建含有BolA33'UTR的報(bào)告基因載體，與miR-374a過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-374a對(duì)BolA33'UTR的靶向性。

5、　　2.BolA3基因的克隆表達(dá)及特異性抗體制備:為了研究BolA3在細(xì)胞中的功能，需要進(jìn)行細(xì)胞中BolA3蛋白表達(dá)檢測(cè)，因?yàn)闆](méi)有用于表達(dá)檢測(cè)合適的市售抗體，我們制備了BolA3的多克隆抗體。①基因克隆:從人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出BolA3基因。②載體構(gòu)建:將克隆基因構(gòu)建入pQE30原核表達(dá)載體中。③蛋白誘導(dǎo)表達(dá):在大腸桿菌中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，Western blotting方法鑒定帶有His標(biāo)簽的重組

6、BolA3蛋白，分析蛋白表達(dá)形式。④蛋白純化:使用Ni柱親和層析法純化該蛋白。⑤抗體制備:程序免疫大耳白兔，耳緣靜脈采血分離免疫后兔血清，ELISA方法檢測(cè)血清中抗體滴度。⑥抗體鑒定:通過(guò)Western blotting方法，檢測(cè)制備的抗體與原核及真核表達(dá)的BolA3蛋白結(jié)合特異性。
　　3.BolA3在細(xì)胞中的定位分布及對(duì)ATP生成的研究:①蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá):培養(yǎng)多種肺、肝、腎、腦等細(xì)胞系，裂解細(xì)胞，蛋白電泳，通過(guò)West

7、ern blotting方法利用制備的多克隆抗體檢測(cè)多種細(xì)胞系中BolA3的內(nèi)源性表達(dá)。②真核表達(dá)載體構(gòu)建:PCR擴(kuò)增出BolA3基因片段，構(gòu)建入pMD18-T載體，雙酶切從pMD18-T上切下BolA3基因片段，構(gòu)建入相同酶切的pEGFP-C1載體中。③蛋白定位:構(gòu)建的EGFP-BolA3融合表達(dá)的真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)到綠色熒光的表達(dá)。通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綠色熒光的細(xì)胞與不同定位熒光標(biāo)記的共定位情況，檢測(cè)BolA3的

8、細(xì)胞定位。④BolA3表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞功能的影響:建立BolA3抑制模型，篩選BolA3 RNAi的有效區(qū)域，構(gòu)建重組表達(dá)BolA3 RNAi腺病毒，感染細(xì)胞后定量PCR法和Westem-Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BolA3的表達(dá)抑制情況，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染上述腺病毒抑制細(xì)胞內(nèi)BolA3表達(dá)后，對(duì)細(xì)胞增殖的影響。利用熒光法檢測(cè)抑制細(xì)胞內(nèi)BolA3表達(dá)對(duì)細(xì)胞ATP生成的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在中東呼吸綜合征冠狀病毒

9、(MERS-CoV)感染的細(xì)胞的表達(dá)芯片進(jìn)行差異篩選中發(fā)現(xiàn):①M(fèi)ERS-CoV引起miRNA差異表達(dá)譜分析，篩選出7個(gè)信號(hào)值有明顯上升的miRNA，并從中篩選出1個(gè)可能在MERS-CoV感染致病中有重要作用的miRNA miR-374a，通過(guò)qPCR驗(yàn)證了MERS-CoV能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-374a的表達(dá);②功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明miR-374a在細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖;③在MERS-CoV影響miR-374a表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，m

10、iR-374a可能靶向調(diào)控BolA33'-UTR。分析該分子可能在MERS-CoV感染致病通路中起到重要作用;④qPCR方法對(duì)MERS-CoV在細(xì)胞中調(diào)控BolA3表達(dá)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示MERS-CoV感染細(xì)胞后，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)BolA3;⑤miR-374a靶向BolA3的鑒定:qPCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-374a能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平上抑制BolA3的表達(dá);熒光素酶檢測(cè)報(bào)告基因結(jié)果說(shuō)明miR-37

11、4a能夠靶向抑制BolA33'UTR。
　　2.BolA3蛋白在細(xì)胞中的功能研究:①抗BolA3多克隆抗體制備和鑒定:轉(zhuǎn)化構(gòu)建的BolA3原核表達(dá)載體入M15感受態(tài)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用純化獲得的蛋白程序免疫大耳白，獲得免疫后兔血清，Western blotting方法鑒定所制備抗體對(duì)原核及真核表達(dá)BolA3蛋白的結(jié)合具有高度特異性;②使用制備的抗體檢測(cè)到BolA3在人肺、神經(jīng)、肝和腎細(xì)胞系中均有內(nèi)源性表達(dá)，提示其在機(jī)體的功能廣泛;

12、③將成功構(gòu)建的EGFP-BolA3融合表達(dá)的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-BolA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到BolA3蛋白與線粒體標(biāo)記物共定位于線粒體和細(xì)胞核;④建立BolA3抑制模型，制備重組表達(dá)BolA3 RNAi腺病毒，感染細(xì)胞，檢測(cè)其可以有效抑制細(xì)胞內(nèi)BolA3的表達(dá)。使用腺病毒感染細(xì)胞，檢測(cè)到抑制BolA3的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行性死亡。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):抑制細(xì)胞內(nèi)BolA3的表達(dá)能抑制細(xì)胞內(nèi)能量代謝中的重要分

13、子--ATP的生成。
　　研究結(jié)論:
　　1.本研究對(duì)miRNA在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)感染致病過(guò)程中的作用進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MERS-CoV感染細(xì)胞可以影響多種宿主細(xì)胞miRNA的變化，其中MERS-CoV感染可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-374a的表達(dá)而靶向抑制BolA3的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生存。
　　2.針對(duì)miR-374a的靶基因，本研究對(duì)BolA3基因在細(xì)胞中的分布、定位及其對(duì)ATP生成的