藏藥材“歐貝”類綠絨蒿“清肝熱、肺熱”功效與活性化學(xué)物質(zhì)相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　藏藥材“歐貝”類綠絨蒿是罌粟科Papaveraceae綠絨蒿屬Meconopsis多種植物的花，是在藏族地區(qū)具有悠久的使用歷史和廣泛應(yīng)用的藏民族藥材。據(jù)統(tǒng)計，約有120種藏藥制劑使用綠絨蒿類藥材入藥。由于藏醫(yī)臨床根據(jù)藏醫(yī)藥典籍，僅以綠絨蒿植物的花入藥，但花產(chǎn)量極低，野生資源不足；并且藏醫(yī)“清肝熱、肺熱”主要只以紫色或藍紫色花入藥，黃色花和紅色花不用或少用；另外，藥材的過度采挖，使用面窄，導(dǎo)致綠絨蒿屬一些關(guān)鍵藥

2、用物種已處于瀕危狀態(tài)；同時，綠絨蒿生長在海拔3000～5000米的高山草甸、高山灌叢、流石灘等脆弱生態(tài)環(huán)境中，生長期短，野生植物資源珍稀，僅以產(chǎn)量極低的花入藥，造成了該類植物的資源巨大浪費，但是以植珠同等入藥又無確切依據(jù)和科學(xué)實驗數(shù)據(jù)支撐。因此，開展野生綠絨蒿屬藥用植物資源的研究，為部分資源豐富的綠絨蒿物種植珠及不同花色的物種同等入藥提供依據(jù)，以期解決僅以產(chǎn)量極低的紫色或藍色花入藥的困境，對避免藏醫(yī)臨床用量最大的“清肝熱、肺熱”的“歐貝

3、”類紫色或藍紫色花的綠絨蒿野生植物資源瀕臨滅絕，保障綠絨蒿藥材和藏藥經(jīng)典成方制劑中綠絨蒿配伍的有效供給具有重要意義。
　　黃色花的全緣葉綠絨蒿 Meconopsisintegrifolia(Maxim.)Franch、紅色花的紅花綠絨蒿M. puniceaMaxim和藍紫色花的川西綠絨蒿M.henriciBur.et Franch為藏藥經(jīng)典巨著《月王藥診》、《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》等記載的多基源藥材“歐貝”類綠絨蒿的三個來源物種

4、，本課題通過比較三種不同花色的綠絨蒿植株對肝損傷和肺損傷的活性、不同花色的綠絨蒿花對炎癥細胞的活性、花和植株提取物體外抗氧化活性研究，篩選出抗氧化活性最強、對肝損傷和炎癥細胞作用效果較好的、目前野生植物資源較豐富的全緣葉綠絨蒿進行深入研究；利用UPLC-MS/MS技術(shù)、HSCCC技術(shù)對全緣葉綠絨蒿的主要化學(xué)成分進行研究，采用譜-效關(guān)系法初步確定活性指紋圖譜中各色譜峰與抗氧化作用的相關(guān)性，確立活性物質(zhì)，揭示全緣葉綠絨蒿的活性化學(xué)成分。

5、r>　　方法與結(jié)果：
　　1.藏藥材綠絨蒿的生藥鑒別研究
　　采用原植物和藥材性狀比較，光鏡（OM）法觀察根、花葶、葉、花的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)顯微特征，掃描電鏡（SEM）法觀察花粉粒形態(tài)對三種綠絨蒿進行鑒別。結(jié)果表明：（1）原植物和性狀特征可根據(jù)花顏色不同或植株大小區(qū)分；（2）顯微組織結(jié)構(gòu)特征可根據(jù)根的木質(zhì)化程度和葉的主脈維管束差異鑒別；（3）粉末特征以花粉囊內(nèi)壁細胞的特征差異最為明顯；（4）花粉粒表面特征：全緣葉綠絨蒿和紅花綠絨

6、蒿的花粉粒為球形或近球形，無萌發(fā)孔，全緣葉綠絨蒿花粉粒上的刺狀突起較紅花綠絨蒿鈍，紅花綠絨蒿花粉粒表面比全緣葉綠絨蒿平滑；川西綠絨蒿花粉粒類型為3孔溝，表面具刺狀雕紋。因此，三種綠絨蒿的原植物、性狀、內(nèi)部顯微組織結(jié)構(gòu)、粉末特征、花粉粒表面特征等區(qū)別明顯，可為藏醫(yī)臨床常用的三種綠絨蒿藥材的鑒別提供參考依據(jù)。
　　2.大孔樹脂富集純化藏藥材全緣葉綠絨蒿總黃酮的工藝研究
　　以總黃酮含量為考察指標，對AB-8、D101、HPD45

7、0和HPD6004種大孔樹脂富集純化全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的吸附和解吸性能進行評價。D101樹脂純化全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的最佳條件為：上樣質(zhì)量濃度0.30 g生藥/mL，洗脫液體積流量為3 BV/h，最佳吸附容量為51.2 mL/g，以4 BV蒸餾水洗脫去除雜質(zhì)后，換用50％乙醇4 BV洗脫。經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集和純化后，全緣葉綠絨蒿總黃酮的純度由2.47%上升至33.83%，回收率為91.35%。所建立的D101大孔吸附樹脂

8、富集和純化全緣葉綠絨蒿總黃酮的方法簡單可行，可為綠絨蒿植株提取物的活性對比研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　3.三種不同花色綠絨蒿花和植株抗氧化活性和“清肝熱、肺熱”功效研究
　　3.1三種不同花色綠絨蒿花的醇提物和植株總黃酮體外抗氧化作用研究
　　采用紫外分光光度法測定三種綠絨蒿花的提取物和植株（不帶花）總黃酮中的總多酚和總黃酮含量，測定三種綠絨蒿花70%乙醇提取物和三種綠絨蒿植株總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能

9、力、總抗氧化能力和抑制超氧陰離子自由基能力，以比較研究三種不同花色綠絨蒿花70%乙醇提取物和綠絨蒿植株總黃酮的體外抗氧化作用。結(jié)果表明，全緣葉綠絨蒿花的70%乙醇提取物和全緣葉綠絨蒿植株的總多酚、總黃酮含量最高，總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力均最強；川西綠絨蒿植株總黃酮抑制超氧陰離子自由基的能力最強；三種不同花色綠絨蒿花70%乙醇提取物具有促進產(chǎn)生超氧陰離子自由基生成的作用。全緣葉綠絨蒿花的醇提取物和植株提

10、取物對多種自由基具有很強的清除作用，在氧化應(yīng)激方面疾病的治療有很好的應(yīng)用前景，為綠絨蒿植株提取物代替花入藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　3.2三種不同花色綠絨蒿花的醇提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥作用的比較研究
　　比較三種不同花色綠絨蒿花的醇提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥作用的差異。采用1μg/mLLPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥，CCK-8法檢測細胞活性，Griess法測定NO的含量，ELISA法測定細胞

11、分泌的TNF-α、IL-6、IL-10含量，熒光酶標儀檢測細胞Caspase3/7表達，DCFH-DA法測定細胞內(nèi)ROS水平。當花的醇提取物濃度小于50μg/mL時，三種綠絨蒿花醇提取物對細胞無明顯毒性作用，超過該濃度則有一定的細胞毒性；三種綠絨蒿花的醇提取物對NO的生成有促進作用；高濃度的三種綠絨蒿花的醇提取物對細胞分泌的TNF-α有一定的抑制作用；低濃度的全緣葉綠絨蒿花醇提取物（20μg/mL）能顯著抑制IL-6的生成，低濃度的紅花

12、綠絨蒿花的醇提取物對IL-6有一定的抑制作用，高濃度的川西綠絨蒿花醇提取物（200μg/mL）對IL-6有顯著的抑制作用；低濃度的三種綠絨蒿花醇提取物（20μg/mL）對IL-10有顯著的促進作用；三種綠絨蒿花醇的提取物對LPS致炎的RAW264.7細胞Caspase3/7的表達有抑制作用；三種綠絨蒿花的醇提取物均能顯著降低炎癥細胞產(chǎn)生的ROS，以全緣葉綠絨蒿花醇提取物的作用效果最好。結(jié)果表明，三種不同顏色綠絨蒿花的醇提取物均對LPS誘

13、導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥有一定的抑制作用，其中全緣葉綠絨蒿花的醇提取物對細胞炎癥導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制效果最好，為三種花色綠絨蒿能否等同入藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　3.3三種不同花色綠絨蒿植株總黃酮對小鼠肝損傷保護作用的比較研究
　　比較三種不同花色綠絨蒿植株總黃酮對小鼠肝損傷的改善作用，初步證明不同花色綠絨蒿植株總黃酮可等同入藥用于肝病治療。采用刀豆蛋白A構(gòu)建小鼠肝損傷模型，兩種劑量（0.1、0.3 g/kg）給藥，連續(xù)6

14、天，試驗結(jié)束后，檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）含量；檢測肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活力或含量；觀察肝組織HE染色的變化。結(jié)果表明，三種綠絨蒿植株總黃酮能顯著降低血清中ALT、AST、LDH水平（P<0.05或P<0.01），升高肝組織中SOD活性，降低MDA含量，但對組織中GSH、CAT作用效果不明顯；川西綠絨蒿

15、植株總黃酮能改善肝組織的病理學(xué)改變。三種綠絨蒿植株總黃酮都有一定的肝保護作用，紫色花的川西綠絨蒿對肝損傷的保護作用效果最好，全緣葉綠絨蒿對SOD活性升高最明顯，可有效緩解因肝損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。
　　3.4三種不同花色綠絨蒿提取物對脂多糖致小鼠肺損傷的作用
　　比較三種不同花色綠絨蒿提取物對小鼠肺損傷的作用。用吸入脂多糖（LPS）的方法構(gòu)建小鼠肺損傷模型，采用肺組織HE染色評價小鼠肺部炎癥，肺濕/干重比值（W/D）評價肺組織

16、的水腫程度，ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，檢測肺組織中SOD、MDA和MPO含量。結(jié)果表明，紅花綠絨蒿提取物對LPS引起的急性肺炎而導(dǎo)致的病理形態(tài)改變具有顯著的改善作用；與正常對照組相比，LPS組W/D比值顯著升高，但三種綠絨蒿提取物并不能明顯降低肺損傷小鼠肺的W/D比值；三種綠絨蒿提取物能不同程度降低血清中TNF-α含量和升高肺組織中SOD活性，但對血清中IL-1β、IL-6和肺組織中MDA、MPO含量無

17、明顯影響。結(jié)果表明，紅花綠絨蒿對小鼠肺損傷有一定的保護作用，全緣葉綠絨蒿和川西綠絨蒿的作用效果不明顯。因此，藏醫(yī)較少使用綠絨蒿藥材用于肺部疾病的治療有一定科學(xué)依據(jù)。
　　4.高速逆流色譜法分離純化藏藥材全緣葉綠絨蒿花的黃酮類成分
　　應(yīng)用高速逆流色譜（HSCCC）法分離制備全緣葉綠絨蒿花中的黃酮類成分，初步闡明全緣葉綠絨蒿花的化學(xué)成分組成。以乙酸乙酯/正丁醇/水（2∶3∶5，v/v/v）為溶劑系統(tǒng)，循環(huán)水浴溫度35℃，UV檢

18、測波長254nm，轉(zhuǎn)速900 r/min，正轉(zhuǎn)，流速2.0 mL/min。從600 mg粗提物中分離得到60 mg槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（1），40 mg槲皮素-3-O-[2'''-O-乙?；?β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（2），11 mg槲皮素-3-O-[3'''-O-乙?；?β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（3），16 mg槲皮素-3-O-[6'''-O-乙?；?

19、β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（4），純度分別為98%、95%、90%、92%，所得化合物經(jīng) MS和NMR確認結(jié)構(gòu)式。4個化合物均首次從全緣葉綠絨蒿分離得到，其中3和4為新發(fā)現(xiàn)的乙?；纹に剀?。
　　5.全緣葉綠絨蒿譜效關(guān)系及質(zhì)量評價研究
　　5.1全緣葉綠絨蒿抗氧化作用的譜效關(guān)系研究
　　探討全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的抗氧化作用與其UPLC指紋圖譜間的譜-效關(guān)系，初步闡明其活性物質(zhì)基礎(chǔ)。采用UPLC法獲

20、取全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的指紋圖譜，應(yīng)用紫外分光光度法檢測全緣葉綠絨蒿植株總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力、總抗氧化能力、抑制超氧陰離子自由基能力進行測定，利用主成分分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析法對色譜-抗氧化能力數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，采用UPLC-MS/MS分析全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的主要化學(xué)成分。結(jié)果從UPLC指紋圖譜中共提取出29個能夠標示全緣葉綠絨蒿植株總黃酮的共有峰，通過主成分分析選出DPPH自由基清除能力和抑制超氧陰離子自

21、由基能力兩個指標的數(shù)據(jù)與29個共有峰進行關(guān)聯(lián)，將關(guān)聯(lián)度大于0.7的共有峰初步認為是全緣葉綠絨蒿植株總黃酮抗氧化的主要活性成分，認為全緣葉綠絨蒿植株總黃酮抗氧化作用為多個化合物協(xié)同作用的結(jié)果。通過UPLC-MS/MS分析得知全緣葉綠絨蒿植株總黃酮提取物中主要化合物為槲皮素的糖苷，另含有少量生物堿。
　　5.2 UPLC法測定全緣葉綠絨蒿花的主要成分的含量
　　通過建立同時測定全緣葉綠絨蒿花中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1

22、→6)-β-D-葡萄糖苷（RS1）、槲皮素-3-O-[2'''-O-乙?；?β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（RS2）和異槲皮苷（RS3）的UPLC法，以評價全緣葉綠絨蒿花藥材。色譜條件參照前期UPLC分離全緣葉綠絨蒿花提取物已建立的色譜條件。ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8μm），柱溫35℃，流速300μL/min，進樣量2μL，檢測波長范圍210～400 nm，流動相：乙腈（A

23、）～0.1%冰醋酸水（B），等度洗脫，0～10 min，16%A。結(jié)果表明，RS1、RS2和RS3分別在0.02504～0.5008 mg/mL（R2=1.0000）、0.02502～0.5004 mg/mL（R2=0.9999）、0.006275～0.2008 mg/mL（R2=0.9998）呈良好線性關(guān)系；平均回收率分別為103.39%、102.13%、90.36%，RSD%均小于2.83%。該方法簡單、快速、準確，可作為全緣葉綠絨

24、蒿花的主要化學(xué)成分含量測定的方法。結(jié)果表明，在所采集的樣品中，全緣葉綠絨蒿花的主要成分含量與產(chǎn)地、海拔、采收月份均有關(guān)系，以小金縣和馬爾康縣海拔較高地區(qū)5～6月份采集的全緣葉綠絨蒿花品質(zhì)較好。
　　結(jié)論：
　　1.花的顏色、植株大小、根的差異、花粉囊內(nèi)壁細胞差異、花粉粒特征可作為三種綠絨蒿的生藥鑒定依據(jù)。
　　2.川西綠絨蒿的植株有很好的肝損傷保護作用，可建議將植株與花等同入藥治療肝病。黃色花的全緣葉綠絨蒿花和植株都有

25、很強的抗氧化活性，對動物肝損傷也有很好的保護作用，建議將其花和植株與藍紫色花的川西綠絨蒿等同入藥。
　　3.首次采用HSCCC法對全緣葉綠絨蒿花提取物的主要化學(xué)成分進行分離純化，從中得到4個化合物，均為首次從全緣葉綠絨蒿中得到，有2個化合物為新發(fā)現(xiàn)的化合物。
　　4.首次采用譜-效關(guān)系研究全緣葉綠絨蒿的抗氧化活性成分，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分為槲皮素糖苷，并且全緣葉綠絨蒿植株與花中有相似的成分組成。
　　5.首次采用UPLC