斑馬魚倍增基因igfbp-1a-igfbp-1b突變體的構(gòu)建以及在脅迫條件下的表達(dá)差異和響應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、IGFBP-1是IGF結(jié)合蛋白家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和鑒定的成員，一些分解代謝脅迫條件（如禁食、營(yíng)養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)限制）能夠誘導(dǎo)IGFBP-1 mRNA的高量表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明，缺乏單一氨基酸（如精氨酸、半胱氨酸、精氨酸等）能夠誘導(dǎo)IGFBP-1的表達(dá)。其它分解代謝脅迫條件包括ER(endoplasmic reticulum)脅迫以及低氧也能夠調(diào)節(jié)IGFBP-1的表達(dá)。目前已經(jīng)克隆得到斑馬魚（Danio rerio）的igfbp-1具有兩個(gè)倍

2、增基因，命名為igfbp-1a和igfbp-1b，是人類IGFBP-1的直系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析和共線性數(shù)據(jù)表明硬骨魚類的進(jìn)化經(jīng)歷了2R(the twobasal vertebrate tetraploidization)和3R(the third tetraploidization)基因組倍增，這為基因功能進(jìn)化的進(jìn)程研究提供了有利的條件。倍增基因在功能上是否存在差異以及存在哪些差異有待進(jìn)一步研究。研究已經(jīng)揭示igfbp-1a、igf

3、bp-1b受饑餓以及低氧等因素調(diào)控，但脅迫條件下IGFBP-1對(duì)IGF功能的抑制以及對(duì)環(huán)境變化的快速反應(yīng)之間的作用關(guān)系還沒(méi)有得到深入的研究，并且之前所有報(bào)道均未揭示igfbp1a、igfbp-1b受饑餓調(diào)節(jié)的發(fā)生機(jī)制。
　　我們分析發(fā)現(xiàn)igfbp-1a含有兩個(gè)保守的AARE元件，其中一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1454/-1446區(qū)域:TGATGCAAC;另一個(gè)位于第一個(gè)內(nèi)含子的+483/+491區(qū)域:ATTTCATCA。但我們?cè)趇

4、gfbp-1b中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的AARE保守序列。為了確定AARE對(duì)氨基酸缺乏是否有響應(yīng)，我們用pGL3-basic、p1128Luc、p2025Luc報(bào)告質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行啟動(dòng)子響應(yīng)活性的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明斑馬魚igfbp-1a轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的AARE元件對(duì)亮氨酸缺乏有響應(yīng)。ZF4細(xì)胞中亮氨酸缺乏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亮氨酸缺乏對(duì)igfbp-1amRNA的表達(dá)沒(méi)有上調(diào)作用，在ZF4細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到igfbp-1b的表達(dá)。我們制備了斑

5、馬魚Igfbp-1a、Igfbp-1b的多克隆抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示二者均具有良好的特異性和較高的效價(jià)，可以用于斑馬魚Igfbp-1a和Igfbp-1b的蛋白檢測(cè)。蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，在ZF4細(xì)胞中，亮氨酸缺乏對(duì)Igfbp-1a與Igfbp-1b的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　本文中我們采用TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚倍增基因igfbp-1a、igfbp-1b基因進(jìn)行敲除，得到了純合敲除突變體。igfbp-1a、igfbp-1