UB-TfR系統(tǒng)的建立和EGFR基因突變與EML4-ALK融合基因的檢測.pdf

1、胞內(nèi)體蛋白分選是泛素調(diào)控內(nèi)吞作用中的關(guān)鍵步驟，泛素標(biāo)記的蛋白被胞內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(ESCRT)識別后，分選進(jìn)入溶酶體途徑進(jìn)行降解。泛素是胞內(nèi)體蛋白分選和降解調(diào)控中重要的信號，可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞的蛋白從胞內(nèi)體通過MVB進(jìn)入溶酶體的降解途徑。Tom1L1也可以與泛素結(jié)合。PR-619是一種可逆的(DUBs)的抑制劑，可以延長Ubiquitin信號，而ESCRT復(fù)合物蛋白的Hrs和TSG101在泛素化蛋白分選過程中也起著重要作用。
　　

2、目的:
　　泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Ub-TfR)融合蛋白由于有泛素的標(biāo)記，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在胞內(nèi)體上被分選進(jìn)入多泡體/溶酶體的降解途徑，不是沿著轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通路再循環(huán)內(nèi)體回到細(xì)胞質(zhì)膜的經(jīng)典途徑，在研究胞內(nèi)體蛋白分選途徑過程的共同機(jī)制中，成為了一個非常理想的標(biāo)記。所以泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建，我們能夠很好的研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)載體
　　采用雙酶切方法

3、，將泛素基因和轉(zhuǎn)鐵受體蛋白基因克隆于表達(dá)載體pCI-neo-HA中，測序正確后提取質(zhì)粒。
　　2.泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白載體的表達(dá)及鑒定
　　測序正確的Ub-TfR表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液。通過Western blot、免疫熒光等檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)。
　　3.PR-619在A431和hela細(xì)胞系中條件優(yōu)化
　　通過Western blot檢測PR-619在A431和hela細(xì)胞系中的最佳條

4、件
　　4.Hrs和TSG101 siRNA的最佳條件優(yōu)化
　　通過Western blot檢測Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件
　　結(jié)果:
　　1.Ub-TfR載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定
　　通過酶切后連接，后送公司測序。測序正確后，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后裂解細(xì)胞，離心獲得細(xì)胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為95KDa，表明為目的蛋白。免疫熒光證實了泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)吞后不再

5、回到到細(xì)胞膜，而是通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞內(nèi)體。
　　2.PR-619在hela細(xì)胞和A431細(xì)胞中的最佳刺激濃度是30uM，最佳刺激時間是3小時; Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件都是是轉(zhuǎn)染后48小時。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了pCl-neo-Ub-TfR表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后表達(dá)的Ub-TfR蛋白明顯增高。免疫熒光證實了泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)吞后不再回到到細(xì)胞膜，而是進(jìn)入內(nèi)吞途徑并進(jìn)入胞內(nèi)體。

6、為進(jìn)一步研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　2.PR-619在hela細(xì)胞和A431細(xì)胞中的最佳刺激濃度是30uM，最佳刺激時間是3小時; Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件是轉(zhuǎn)染后48小時。這些條件都為進(jìn)一步研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 EGFR基因與EML4-ALK融合基因突變的檢測
　　近年來，肺癌由于其明顯上升的發(fā)病率和死亡率，已經(jīng)成為了目前死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的主要類

7、型包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，而85％的肺癌則被診斷為非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌占15％。肺癌最主要的治療手段是綜合治療，這些綜合治療主要包括手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療。據(jù)最新研究表明，靶向藥物治療對于非小細(xì)胞肺癌患者而言是一個比較好的選擇。隨著人們對肺癌分子靶點不斷深入的研究，特異性高且不良反應(yīng)輕的分子靶向藥物逐漸成為人們關(guān)注的焦點。靶向藥物治療主要是以EGFR基因和EML4-ALK融合基因等肺癌驅(qū)動基因突變?yōu)榘悬c的，所以肺癌在進(jìn)

8、行靶向藥物治療之前的基因檢測也是非常必要的。
　　EGFR是一種分子質(zhì)量為170kDa的細(xì)胞膜受體，是一種受體型酪氨酸激酶。非小細(xì)胞肺癌的形成和發(fā)展過程中，表皮生長因子受體(EGFR)信號通路起著至關(guān)重要的作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的活化可被表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)選擇性地抑制，從而其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被有效阻斷，在NSCLC中的療效比較好。所以EGFR突變是靶向藥物TKI治療效果的重要預(yù)測指標(biāo)之一

9、。EML4-ALK由棘皮動物微管查關(guān)蛋白樣-4(EML4)與漸變性淋巴瘤激酶(ALK)兩者的部分基因融合而成，EML4-ALK融合基因是NSCLC中的分子靶標(biāo)之一。EML4-ALK融合基因突變在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。
　　目的:為了給NSCLC患者的靶向藥物治療提供更為可靠的依據(jù)，EGFR基因突變和EML4-ALK基因突變的檢測是很有必要的。有效的生物標(biāo)志物的篩選不僅僅能夠改善療效，同時還可以提高患者治療成

10、功率。
　　方法:
　　1.EGFR基因突變檢測
　　采用PCR擴(kuò)增和基因測序方法檢測252例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因外顯子19和21的突變情況。
　　2.EML4-ALK融合基因突變檢測
　　采用Realtime-PCR的方法檢測EML4-ALK融合基因的突變情況。
　　結(jié)果:
　　1.EGFR基因突變與臨床特征的相互關(guān)系252例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本EGFR的突變率為38.8％（98例），其中

11、19外顯子突變率為15.8％(40例)，21外顯子突變23.0％（58例）。EGFR突變的患者多為女性、無吸煙史和腺癌(P＜0.05)，與患者年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　2.EML4-ALK融合基因突變與臨床特征的相互關(guān)系
　　252例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中，EML4-ALK融合基因突變率4.7％（12例）。EML4-ALK基因突變患者多為女性和年齡較小者(P＜0.05)，與患者吸煙史和病理類型無關(guān)(P＞0.05)。

12、r>　　3.EGFR和EML4-ALK的突變共存情況
　　沒有檢測到EGFR和EML4-ALK的突變共存情況。
　　結(jié)論:
　　1.中國人中NSCLCs的EGFR突變率較高，在使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療前進(jìn)行EGFR基因突變檢測很有必要。
　　2.EML4-ALK基因突變在NSCLC的發(fā)現(xiàn)，使臨床NSCLC患者有了一種新的可供選擇的治療方案。
　　3.EML4-ALK融合基因突變與EGFR突變共存是罕