PBEF在重癥胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用及清胰湯干預(yù)的實驗研究.pdf

1、急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上一種常見的急性腹部疾病，約有15～20%的患者發(fā)展成為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）。SAP的病情發(fā)展迅速，并發(fā)癥多，因而在臨床上死亡率一直居高不下。在SAP發(fā)展的早期階段，肺部是首先受到損傷的胰外器官，造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI），ALI的進(jìn)一步發(fā)展可以導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute res

2、piratory distress syndrome，ARDS），ARDS是SAP早期死亡的重要原因。SAP導(dǎo)致ALI的發(fā)病機制有多方面的因素，涉及到內(nèi)毒素、腸屏障、微循壞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子連鎖反應(yīng)等多個相關(guān)的環(huán)節(jié)。機體過度失控的炎癥反應(yīng)以及促炎介質(zhì)的大量釋放可能是在ALI的發(fā)生中起關(guān)鍵性作用的因素，這一點國內(nèi)外專家和學(xué)者已經(jīng)形成共識。
　　前B細(xì)胞克隆增強因子（pre-B-cell colony-enhancing facto

3、r，PBEF）是一種肽類激素，作為具有促進(jìn)B前體細(xì)胞成熟功能的細(xì)胞因子于1994年首次被發(fā)現(xiàn)。PBEF的主要生理學(xué)功能為調(diào)控B細(xì)胞的細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。2005年，美國學(xué)者葉水清教授等對ALI動物模型和病人的PBEF基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PBEF在ALI診斷中具有生物標(biāo)志作用，也提示其在急性肺部疾病的基因診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。研究表明，PBEF參與了膿毒癥患者和機械通氣所致的急性肺損傷。在對一些疾病的研究中還發(fā)現(xiàn)，PBEF可

4、以延緩中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear leukocytes，PMN）凋亡，PMN的凋亡延遲會導(dǎo)致炎癥因子釋放增多，加重炎癥反應(yīng)。有學(xué)者在對急性胰腺炎的研究發(fā)現(xiàn)，患者血液中的PBEF表達(dá)量與疾病發(fā)展程度呈正相關(guān)。
　　多年的臨床觀察和實驗研究已經(jīng)證實，中藥清胰湯通過通里攻下、清熱解毒、活血化瘀、疏肝理氣等機制能夠有效治療急性胰腺炎，并在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。其組方中的大黃和芒硝為是典型的通里攻下藥，也是《傷寒論》經(jīng)

5、典名方——大承氣湯的主要組成部分，具有峻下熱結(jié)、軟堅潤燥、破痞除滿等功效。大黃的主要活性成分——大黃素（Emodin）已被證實具有多種藥理學(xué)功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，清胰湯可以減輕SAP導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、改善SAP導(dǎo)致的器官損傷等等，對于防止SAP的進(jìn)一步發(fā)展發(fā)揮重要作用。雖然對于清胰湯在SAP中的作用已經(jīng)有較多報道，但是對于清胰湯在SAP中的作用機制仍不十分清楚。本課題主要探討清胰湯及大黃的主要活性成分大黃素是否通過抑制PBEF、促進(jìn)PM

6、N細(xì)胞凋亡而對SAP發(fā)揮治療作用，以期從新的角度探討急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機制。并進(jìn)一步探究清胰湯治療SAPALI的作用機理，為臨床上中西醫(yī)結(jié)合治療重癥急性胰腺炎肺損傷提供進(jìn)一步的實驗依據(jù)。
　　本研究制備了SAP-ALI大鼠模型，檢測了對照組、SAP模型組、藥物處理組大鼠血清淀粉酶的含量，并對肺、胰組織進(jìn)行HE染色及TUNEL染色觀察組織病理特征以及細(xì)胞凋亡情況，檢測肺、胰組織的濕/干重比來評估組織水腫情況，綜合探究清胰湯對SA

7、P大鼠的治療作用；通過免疫組化方法觀察肺、胰組織中PBEF蛋白的表達(dá)情況，通過Real-time PCR和Western blot實驗觀察外周血PMN中PBEF的基因和蛋白的表達(dá)情況；并對外周血PMN細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探究清胰湯對肺和胰腺組織中PBEF的表達(dá)及PMN細(xì)胞凋亡的影響。在體外細(xì)胞實驗中，利用LPS刺激外周血PMN細(xì)胞模擬體外炎性環(huán)境，并用大黃素干預(yù)后檢測細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　

8、第一部分：清胰湯對重癥急性胰腺炎大鼠急性肺損傷治療作用的觀察
　　目的：
　　觀察清胰湯對模型的治療作用，探討清胰湯對SAP大鼠肺胰組織損傷、組織水腫以及肺胰細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　采用向胰膽管內(nèi)逆行注射牛黃膽酸鈉溶液的方法制備大鼠SAP模型，用碘-淀粉比色法檢測血清淀粉酶水平，用HE染色觀察肺和胰腺的病理學(xué)變化；用TUNEL法檢測肺和胰腺組織中細(xì)胞凋亡情況，測量肺、胰組織濕/干重比來評估組織水腫程度。

9、
　　結(jié)果：
　　SAP大鼠血清淀粉酶水平明顯升高，清胰湯能夠有效降低淀粉酶水平；HE染色結(jié)果顯示，清胰湯可以改善SAP造成的肺和胰組織出血、炎性細(xì)胞浸潤等情況；濕/干重比檢測結(jié)果顯示，SAP模型大鼠的肺、胰組織水腫嚴(yán)重，在經(jīng)過清胰湯處理之后得到明顯改善；TUNEL檢測顯示，與SAP模型組相比清胰湯處理組大鼠肺、胰細(xì)胞凋亡比例明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　清胰湯能夠降低SAP大鼠血清淀粉酶的水平，能夠緩解SAP造成

10、的肺、胰組織水腫、細(xì)胞壞死等病理學(xué)表現(xiàn)，抑制肺、胰細(xì)胞凋亡。
　　第二部分：清胰湯對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷作用機理探討
　　目的：
　　探討清胰湯對SAP大鼠模型肺和胰腺組織PBEF的表達(dá)、PMN細(xì)胞凋亡的影響及清胰湯治療SAP的分子機制。
　　方法：
　　采用免疫組化檢測各組大鼠肺、胰組織中PBEF的表達(dá)；從大鼠外周血中分離PMN細(xì)胞，用Real-time PCR法檢測PBEF mRNA水平的表達(dá)情況；

11、用Western blot法檢測PBEF蛋白水平的表達(dá)情況；應(yīng)用Annexin V-FITC/PI法對PMN細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN細(xì)胞的凋亡比例；用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-xL的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　免疫組化結(jié)果顯示，在SAP大鼠的肺、胰組織中PBEF表達(dá)量增加，在經(jīng)過清胰湯處理之后，PBEF表達(dá)量下降； Real-ti

12、me PCR和Western blot結(jié)果顯示，在PMN細(xì)胞中，清胰湯能夠下調(diào)PBEF的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN凋亡結(jié)果顯示，SAP大鼠的PMN細(xì)胞凋亡比例顯著低于對照組，經(jīng)過清胰湯處理之后該比例有明顯提高；對其他凋亡相關(guān)的蛋白Western blot結(jié)果顯示，清胰湯上調(diào)Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-xL的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　清胰湯能夠下調(diào)SAP大鼠肺和胰腺組織PBEF

13、的表達(dá)，促進(jìn)SAP大鼠的PMN細(xì)胞凋亡并影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。清胰湯可能是通過下調(diào)PBEF表達(dá)來促進(jìn)PMN細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對SAP起到治療作用。
　　第三部分：體外實驗研究大黃素對PMN細(xì)胞的促凋亡作用
　　目的：
　　通過體外實驗進(jìn)一步驗證大黃素能夠促進(jìn)PMN細(xì)胞凋亡，探討大黃素促進(jìn)PMN凋亡的相關(guān)機理。
　　方法：
　　分離正常大鼠外周血中的PMN細(xì)胞并用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞模擬體外炎性環(huán)境，給予相應(yīng)的藥物處

14、理；運用流式細(xì)胞技術(shù)，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測PMN細(xì)胞的凋亡比例；用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-xL的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　凋亡檢測結(jié)果顯示，LPS能夠顯著抑制PMN細(xì)胞凋亡，而大黃素能夠拮抗這一作用；Western blot得出了與體內(nèi)實驗一致的結(jié)果，即大黃素上調(diào)了促凋亡基因Fas、FasL、Bax、cleaved