Ⅱ型去乙?；冈谟醒踹\動調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　葡萄糖代謝異常是引發(fā)代謝相關(guān)疾病的重要因素之一。眾所周知，規(guī)律的有氧運動是防治機體肥胖、胰島素抵抗(IR)和2型糖尿病(T2DM)的有效手段。機體運動主要是通過骨骼肌收縮和舒張來完成，人體內(nèi)約80％由胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運和利用是由骨骼肌組織完成，因此，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝能夠增強機體組織對胰島素的敏感性，改善 IR、預(yù)防 T2DM的發(fā)生。
　　II型組蛋白去乙?；?HDACs)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子對組織細(xì)

2、胞葡萄糖代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用，II型組蛋白去乙?；钢械?HDAC4和 HDAC5是運動敏感性的組蛋白去乙?；浮Ｓ醒踹\動作為預(yù)防和治療肥胖、IR和多種代謝性疾病的有效手段，其作用機理是否與骨骼肌組織 II型 HDACs的調(diào)控有關(guān)目前尚不完全明了。本研究以 II型 HDACs調(diào)控組織細(xì)胞葡萄糖代謝為線索、以在體動物模型和離體細(xì)胞模型為對象，研究 HDAC4和 HDAC5在有氧運動改善骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取及利用的作用機制。通過在體動物實

3、驗和離體細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方式，研究有氧運動對 C57BL/6小鼠骨骼肌細(xì)胞 HDAC4和HDAC5調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)基因表達(dá)相互作用關(guān)系的影響；并在離體狀態(tài)下探討微小RNA-206(miR-206)調(diào)節(jié)氧化型骨骼肌細(xì)胞 HDAC4基因表達(dá)的具體機制，同時本研究還采用一磷酸腺苷活化蛋白激酶α2(AMPKα2)基因敲除小鼠，研究在 AMPKα2缺失的情況下骨骼肌細(xì)胞 HDAC4和 HDAC5調(diào)控細(xì)胞葡萄糖代謝的變化，為進(jìn)一步揭

4、示 HDAC4和 HDAC5在骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝中的作用機制提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.動物模型的建立
　　5周齡、雄性 C57BL/6小鼠隨機分為正常安靜組(NC)和正常運動組(NE)。5周齡 AMPKα2基因敲除小鼠共有三種基因型，即野生型(WT)、雜合子型(AMPKα2+/-)和純合子型(AMPKα2-/-)。分別將各基因型小鼠隨機分為安靜對照組(C)和有氧運動組(E)。
　　2.腺病毒的構(gòu)建

5、
　　利用 Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建 HDAC4, HDAC5, MEF2A和 AMPKα2過表達(dá)重組腺病毒質(zhì)粒，采用 PacI內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝。AMPKα2顯性負(fù)突變腺病毒是通過 Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒后進(jìn)行點突變，再進(jìn)行腺病毒載體的重組及包裝。
　　3．細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)
　　小鼠肌原細(xì)胞系 C2C12經(jīng)2%馬血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為肌管細(xì)胞。觀察HDAC4,MEF2A和HDAC5

6、過表達(dá)腺病毒以及HDAC4和HDAC5 siRNA干預(yù)肌管細(xì)胞對葡萄糖代謝的影響；檢測 AMPKα2過表達(dá)腺病毒及 AMPKα2顯性負(fù)突變腺病毒對肌管細(xì)胞HDAC4的影響；使用miR-206 mimic和miR-206 inhibitor轉(zhuǎn)染肌管細(xì)胞，觀察葡萄糖代謝的變化。
　　4．生化指標(biāo)檢測
　　采用Real-time PCR檢測基因表達(dá)；采用Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)；使用2-脫氧葡萄糖熒光類似物(2-N

7、BDG)檢測 C2C12肌管細(xì)胞葡萄糖攝取能力；采用免疫共沉淀(Co-IP)檢測蛋白間的相互結(jié)合；采用免疫熒光檢測蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。
　　研究結(jié)果：
　　1. HDAC4/5在有氧運動改善骨骼肌糖代謝中的作用
　　6周有氧運動可以顯著增加小鼠骨骼肌組織 GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)、HDAC4 Ser246位點磷酸化，同時促進(jìn) HDAC4從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿。通過離體細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)肌管細(xì)胞 HDAC4表達(dá)的增加可抑制

8、細(xì)胞 GLUT4轉(zhuǎn)錄及其對葡萄糖攝取能力，當(dāng)增加 MEF2A的表達(dá)水平可逆轉(zhuǎn) HDAC4的抑制作用。
　　HDAC4 siRNA顯著增加肌管細(xì)胞GLUT4基因轉(zhuǎn)錄水平，在此基礎(chǔ)上給予HDAC5 siRNA,GLUT4基因轉(zhuǎn)錄水平被大幅度提高。與之相反，同時過表達(dá)HDAC4和 HDAC5對于 C2C12肌管細(xì)胞 GLUT4的轉(zhuǎn)錄抑制效率顯著高于單獨過表達(dá) HDAC4或 HDAC5。由此推測，骨骼肌細(xì)胞 HDAC4與 HDAC5可能在

9、 GLUT4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮著協(xié)同作用。
　　有氧運動顯著降低氧化型肌纖維 HDAC4和 HDAC5蛋白表達(dá)，然而在酵解型肌纖維中卻無顯著變化。此外，有氧運動也顯著降低骨骼肌細(xì)胞 HDAC4和HDAC5的相互結(jié)合(圖1.8)。由此提示，有氧運動對 HDAC4和 HDAC5蛋白表達(dá)調(diào)控具有肌纖維類型的特異性，對其下游靶基因的抑制作用可能與二者的相互結(jié)合有關(guān)。
　　2. AMPKα2在有氧運動調(diào)控骨骼肌組織 HDAC4/5中

10、的作用
　　離體狀態(tài)下敲低 AMPKα2可導(dǎo)致 HDAC4 Ser246/632位點的磷酸化水平顯著降低，促使 HDAC4從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿。提示骨骼肌細(xì)胞 AMPKα2是HDAC4的上游激酶。
　　單次有氧跑臺運動可以激活野生型小鼠骨骼肌 AMPK-HDAC4信號通路；然而有氧運動未能增加AMPKα2缺失小鼠骨骼肌HDAC4 Ser246/632磷酸化水平，提示運動對于骨骼肌組織 HDAC4的激活依賴于AMPKα2。

11、>　　3. miR-206介導(dǎo) HDAC4在有氧運動提高骨骼肌葡萄糖代謝中的作用機制
　　6周的有氧運動顯著增加氧化型肌纖維 miR-206的表達(dá)水平、抑制HDAC4蛋白表達(dá)、顯著增加 GLUT4 mRNA及蛋白表達(dá)。由此推測有氧運動可能通過 miR-206降低 HDAC4的蛋白表達(dá)，進(jìn)而增加骨骼肌細(xì)胞 GLUT4的轉(zhuǎn)錄。
　　離體研究發(fā)現(xiàn)，miR-206水平的增高可顯著降低 HDAC4的蛋白表達(dá)、增加骨骼肌細(xì)胞 GLUT4

12、基因的轉(zhuǎn)錄、提高了骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取。因此提示 miR-206可能通過抑制 HDAC4促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞 GLUT4的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加了對葡萄糖的攝取能力。
　　采用miR-206 mimic和HDAC4 siRNA共轉(zhuǎn)染肌管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-206和GLUT4的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于單獨使用miR-206 mimic干預(yù)的肌管細(xì)胞。隨后檢測發(fā)現(xiàn)，采用HDAC4 siRNA可顯著降低C2C12肌管細(xì)胞miR-206的表達(dá)水平，甚至與 m

13、iR-206 inhibitor干預(yù)后結(jié)果無顯著差異。由此說明，HDAC4 siRNA反饋性的抑制骨骼肌細(xì)胞 miR-206的表達(dá)。
　　此外，以不同濃度梯度miR-206 mimic孵育肌管細(xì)胞，GLUT4的基因表達(dá)隨著濃度梯度增加而增加，之后轉(zhuǎn)染肌管細(xì)胞過表達(dá) HDAC4腺病毒， GLUT4基因表達(dá)雖顯著高于對照組，但顯著低于單獨使用miR-206 mimic干預(yù)組，提示 miR-206通過 HDAC4調(diào)控肌管細(xì)胞 GLUT4

14、的基因表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1. HDAC4通過 MEF2A調(diào)控骨骼肌細(xì)胞 GLUT4的基因轉(zhuǎn)錄，且在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的過程中 HDAC4/5可能發(fā)揮著協(xié)同作用。有氧運動對于 HDAC4/5的影響具有肌纖維類型的特異性，唯有在氧化型肌纖維中的表達(dá)水平顯著降低，可能是有氧運動促進(jìn)骨骼肌有氧氧化，提高機體對糖脂代謝的重要機制。
　　2. AMPK能夠調(diào)控骨骼肌細(xì)胞 HDAC4活性。單次有氧運動通過 AMPKα2所依賴的方式激